Ukr.Biochem.J. 2018; Том 90, № 5, вересень-жовтень, c. 98-105

doi: https://doi.org/10.15407/ubj90.05.098

Методи очистки та визначення ензиматичної активності лізилоксидази

07.11.2018   Uncategorized   No comments

О. О. Гудкова, Н. В. Латишко, О. В. Зайцева, С. Г. Шандренко

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: gudkovahelga@gmail.com

Метою роботи було екстрагування та часткова очистка лізилоксидази, одержаної із тканин гризунів, простим та ефективним методом, а також розробка чутливого методу визна­чення його активності, який підходить для масштабних лабораторних експериментів in vivo та in vitro. Розроблений метод базується на принципі негативної сорбції полярного гідрофільного адсорбенту каоліну. Активність лізилоксидази оцінювали двома розробленими методами за кількістю пероксиду водню, який утворюється в ході реакції з 1,5-діамінопентаном як субстратом. Н2О2 детектували або за допомогою хемілюмінесценції люмінолу в присутності пер­оксидази хрону, або флуорометрично з використанням фолієвої кислоти в присутності Cu (II). Застосований метод очистки лізилоксидази із тканин гризунів дозволив позбавитись від 93% баластних протеїнів, що показано за допомогою електрофорезу в ПААГ. Питома активність лізилоксидази після процедури часткового очищення була у 10–24 рази вища, ніж у вихідному екстракті. Молекулярна маса ензиму з тканин мишей становила приблизно 32 кДа. Запропоновані методи дозволяють економити час та матеріали у разі масштабних лабораторних досліджень.

Ключові слова: , , , , , ,

Посилання:

  1. Rucker RB, Kosonen T, Clegg MS, Mitchell AE, Rucker BR, Uriu-Hare JY, Keen CL. Copper, lysyl oxidase, and extracellular matrix protein cross-linking. Am J Clin Nutr. 1998 May;67(5 Suppl):996S-1002S. PubMed, CrossRef
  2. Bais MV, Ozdener GB, Sonenshein GE, Trackman PC. Effects of tumor-suppressor lysyl oxidase propeptide on prostate cancer xenograft growth and its direct interactions with DNA repair pathways. Oncogene. 2015 Apr 9;34(15):1928-37. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  3. Ikenaga N, Peng ZW, Vaid KA, Liu SB, Yoshida S, Sverdlov DY, Mikels-Vigdal A, Smith V, Schuppan D, Popov YV. Selective targeting of lysyl oxidase-like 2 (LOXL2) suppresses hepatic fibrosis progression and accelerates its reversal. Gut. 2017 Sep;66(9):1697-1708. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  4. Janyasupab M, Lee YH, Zhang Y, Liu CW, Cai J, Popa A, Samia AC, Wang KW, Xu J, Hu CC, Wendt MK, Schiemann BJ, Thompson CL, Yen Y, Schiemann WP, Liu CC. Detection of Lysyl Oxidase-Like 2 (LOXL2), a Biomarker of Metastasis from Breast Cancers Using Human Blood Samples. Recent Pat Biomark. 2015;5(2):93-100. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  5. Kim S, Park S, Kim Y. Alternative promoter activation leads to the expression of a novel human lysyl oxidase variant that functions as an amine oxidase. Int J Mol Med. 2014 Sep;34(3):894-9. PubMed, CrossRef
  6. Trackman PC. Enzymatic and non-enzymatic functions of the lysyl oxidase family in bone. Matrix Biol. 2016 May-Jul;52-54:7-18. PubMed, PubMed, CrossRef
  7. Romero-Chapman N, Lee J, Tinker D, Uriu-Hare JY, Keen CL, Rucker RR. Purification, properties and influence of dietary copper on accumulation and functional activity of lysyl oxidase in rat skin. Biochem J. 1991 May 1;275(Pt 3):657-62. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  8. Pinnell SR, Martin GR. The cross-linking of collagen and elastin: enzymatic conversion of lysine in peptide linkage to alpha-aminoadipic-delta-semialdehyde (allysine) by an extract from bone. Proc Natl Acad Sci USA. 1968 Oct;61(2):708-16. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  9. Zibadi S, Vazquez R, Moore D, Larson DF, Watson RR. Myocardial lysyl oxidase regulation of cardiac remodeling in a murine model of diet-induced metabolic syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009 Sep;297(3):H976-82. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  10. Li S, Yang X, Li W, Li J, Su X, Chen L, Yan G. N-acetylcysteine downregulation of lysyl oxidase activity alleviating bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Respiration. 2012;84(6):509-17. PubMed, CrossRef
  11. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7;72:248-54. PubMed, CrossRef
  12. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5. PubMed, CrossRef
  13. Palamakumbura AH, Trackman PC. A fluorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity in biological samples. Anal Biochem. 2002 Jan 15;300(2):245-51. PubMed, CrossRef
  14. Diaz AN, Sanchez FG, Garcia JAG. Hydrogen peroxide assay by using enhanced chemiluminescence of luminal-H2O2-horseradish peroxidase system: comparative studies. Anal Chim Acta. 1996;327(2):161-165. CrossRef
  15. Perez FJ, Rubio S. An improved chemiluminescence method for hydrogen peroxidase determination in plant tissues. Plat Growth Regul. 2006;48(1):89-95. CrossRef
  16. Khan P, Idrees D, Moxley MA, Corbett JA, Ahmad F, von Figura G, Sly WS, Waheed A, Hassan MI. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 2014 May;173(2):333-55.  PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  17. Hirakawa K. Fluorometry of hydrogen peroxide using oxidative decomposition of folic acid. Anal Bioanal Chem. 2006 Sep;386(2):244-8. PubMed, CrossRef
  18. Meissner J, Prause A, Bharti B, Findenegg GH. Characterization of protein adsorption onto silica nanoparticles: influence of pH and ionic strength. Colloid Polym Sci. 2015;293(11):3381-3391. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.