Ukr.Biochem.J. 2019; Том 91, № 2, березень-квітень, c. 19-27

doi: https://doi.org/10.15407/ubj91.02.019

Приготування висококонцентрованої аутологічної плазми крові, збагаченої тромбоцитами, для біомедичного використання

В. Чернишенко1, К. Штайнберг2, Н. Луговська1, М. Рижикова1,
Т. Платонова1, Д. Корольова1, Е. Луговськой1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2«Клініка доктора Запольскої», Київ, Україна

Клітинна терапія з використанням тромбоцитів є широко поширеним підходом в медицині для загоєння ран і регенерації тканин. Однак, найдоступніші методи дають змогу отримати не достатньо концентровані суспензії тромбоцитів (до 0,3∙106 1/мкл) або суспензії тромбоцитів, що частково або повністю втратили свою активність. У цьому дослідженні ми поставили за мету розробити простий та ефективний метод приготування суспензії нативних та інтактних тромбоцитів у концентрації понад 1∙106 1/мкл. Збагачену тромбоцитами плазму крові (ЗТПК) отримували зі свіжої крові здорових донорів (n = 5), при заборі крові як антикоагулянт використовували гепарин. Зразки ЗТПК осаджували і ресуспендували в аутологічній плазмі крові. Кількість та життєздатність тромбоцитів у кожному зразку визначали шляхом дослідження агрегації на агрегометрі Solar AP2110. Форма тромбоцитів і гранулярність цитоплазми, які вказують на нативність тромбоцитів, контролювали на потоковому цитометрі COULTER EPICS XL. Дослідження агрегації тромбоцитів у ЗТПК, отриманій з використанням різних кількостей гепарину, дозволило нам знизити кінцеві концентрації до кількості, яка ефективно запобігала зсіданню крові і не впливала на активність тромбоцитів (5 U/мл). ЗТПК, сконцентрована в 5 разів із загальною концентрацією клітин 1∙106 1/мкл, була здатна до активації аденозиндифосфатом (AДФ) (ступінь агрегації 54 ± 7%). Кількість клітин зі зміненою формою та гранулярністю в сконцентрованій суспензії не перевищувала 20%. Ці дані свідчать, про те, що тромбоцити зберігають здатність вивільняти ряд факторів росту та інші біологічно активні сполуки після стимуляції або ін’єкції в тканини за клітинної терапії. Зниження концентрації гепарину до того ж мінімізує крововилив в місці ін’єкції, що сприяє біомедичному застосуванню суспензії. Розроблено простий та ефективний метод приготування високо концентрованої ЗТП (1,2∙106 1/мкл) для біомедичного використання. Агрегатометрія і протокова цитометрія довели, що одержані тромбоцити інтактні й здатні активуватися. Препарат, що є аутологічним,  може бути широко використаний для клітинної терапії без додаткових запобіжних заходів.

Ключові слова: , , , ,


Посилання:

  1. Dhillon RS, Schwarz EM, Maloney MD. Platelet-rich plasma therapy – future or trend? Arthritis Res Ther. 2012 Aug 8;14(4):219. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  2. Galliera E, Corsi MM, Banfi G. Platelet rich plasma therapy: inflammatory molecules involved in tissue healing. J Biol Regul Homeost Agents. 2012 Apr-Jun;26(2 Suppl 1):35S-42S. PubMed
  3. Arshdeep, Kumaran MS. Platelet-rich plasma in dermatology: boon or a bane? Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2014 Jan-Feb;80(1):5-14. PubMed,CrossRef
  4. Singhal P, Agarwal S, Dhot PS, Sayal S. Efficacy of platelet-rich plasma in treatment of androgenic alopecia. Asian J Transfus Sci. 2015 Jul-Dec;9(2):159-62.  PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  5. Frautschi RS, Hashem AM, Halasa B, Cakmakoglu C, Zins JE. Current Evidence for Clinical Efficacy of Platelet Rich Plasma in Aesthetic Surgery: A Systematic Review. Aesthet Surg J. 2017 Mar 1;37(3):353-362.  PubMed, CrossRef
  6. Glynn LG, Mustafa A, Casey M, Krawczyk J, Blom J, Galvin R, Hannigan A, Dunne CP, Murphy AW, Mallen C. Platelet-rich plasma (PRP) therapy for knee arthritis: a feasibility study in primary care. Pilot Feasibility Stud. 2018 Jul 4;4:93. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  7. Intini G. The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy. Biomaterials. 2009 Oct;30(28):4956-66. PubMed, CrossRef
  8. Chicharro-Alcántara D, Rubio-Zaragoza M, Damiá-Giménez E, Carrillo-Poveda JM, Cuervo-Serrato B, Peláez-Gorrea P, Sopena-Juncosa JJ. Platelet Rich Plasma: New Insights for Cutaneous Wound Healing Management. J Funct Biomater. 2018 Jan 18;9(1). pii: E10. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  9. Keene DJ, Alsousou J, Willett K. How effective are platelet rich plasma injections in treating musculoskeletal soft tissue injuries? BMJ. 2016 Feb 17;352:i517. PubMed, CrossRef
  10. Bell KJ, Fulcher ML, Rowlands DS, Kerse N. Impact of autologous blood injections in treatment of mid-portion Achilles tendinopathy: double blind randomised controlled trial. BMJ. 2013 Apr 18;346:f2310. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  11. Grassi A, Napoli F, Romandini I, Samuelsson K, Zaffagnini S, Candrian C, Filardo G. Is Platelet-Rich Plasma (PRP) Effective in the Treatment of Acute Muscle Injuries? A Systematic Review and Meta-Analysis. Sports Med. 2018 Apr;48(4):971-989. PubMed, CrossRef
  12. Fitzpatrick J, Bulsara MK, McCrory PR, Richardson MD, Zheng MH. Analysis of Platelet-Rich Plasma Extraction: Variations in Platelet and Blood Components Between 4 Common Commercial Kits. Orthop J Sports Med. 2017 Jan 3;5(1):2325967116675272. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  13. Chahla J, Cinque ME, Piuzzi NS, Mannava S, Geeslin AG, Murray IR, Dornan GJ, Muschler GF, LaPrade RF. A Call for Standardization in Platelet-Rich Plasma Preparation Protocols and Composition Reporting: A Systematic Review of the Clinical Orthopaedic Literature. J Bone Joint Surg Am. 2017 Oct 18;99(20):1769-1779.  PubMed, CrossRef
  14. Gómez LA, Escobar M, Peñuela O. Standardization of a Protocol for Obtaining Platelet Rich Plasma from blood Donors; a Tool for Tissue Regeneration Procedures. Clin Lab. 2015;61(8):973-80. PubMed, CrossRef
  15. Cattaneo M, Cerletti C, Harrison P, Hayward CP, Kenny D, Nugent D, Nurden P, Rao AK, Schmaier AH, Watson SP, Lussana F, Pugliano MT, Michelson AD. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 2013; 11(6):1183-1189.  PubMed, CrossRef
  16. Chernyshenko V, Petruk N, Korolova D, Kasatkina L, Gornytska O, Platonova T, Chernyshenko T, Rebriev A, Dzhus O, Garmanchuk L, Lugovskoy E. Antiplatelet and anti-proliferative action of disintegrin from Echis multisquamatis snake venom. Croat Med J. 2017 Apr 14;58(2):118-127. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  17. Korolova DS, Chernyshenko TM, Gornytska OV, Chernyshenko VO, Platonova TN. Meizothrombin preparation and its role in fibrin formation and platelet aggregation. Adv Biosci Biotechnol. 2014;5(7):588-595. CrossRef
  18. Gryshchuk V, Galagan N. Silica Nanoparticles Effects on Blood Coagulation Proteins and Platelets. Biochem Res Int. 2016;2016:2959414. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  19. Chernyshenko V, Platonova T, Makogonenko Y, Rebriev A, Mikhalovska L, Chernyshenko T, Komisarenko S. Fibrin(ogen)olytic and platelet modulating activity of a novel protease from the Echis multisquamatis snake venom. Biochimie. 2014 Oct;105:76-83. PubMed, CrossRef
  20. Korol’ova DS, Chernyshenko VO, Hornyts’ka OV, Platonova TM. Influence of prothrombin cleavage products on platelet activation and aggregation. Ukr Biokhim Zhurn. 2009 Sep-Oct;81(5):58-65. (In Ukrainian). PubMed
  21. do Amaral RJ, da Silva NP, Haddad NF, Lopes LS, Ferreira FD, Filho RB, Cappelletti PA, de Mello W, Cordeiro-Spinetti E, Balduino A. Platelet-Rich Plasma Obtained with Different Anticoagulants and Their Effect on Platelet Numbers and Mesenchymal Stromal Cells Behavior In Vitro. Stem Cells Int. 2016;2016:7414036. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  22. Hua L, Lai G, Zhenjun L, Guie M.The study of anticoagulants selection in platelet-rich plasma preparation. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi. 2015 Jul;31(4):295-300. (In Chinese).
  23. Alves R, Grimalt R. A Review of Platelet-Rich Plasma: History, Biology, Mechanism of Action, and Classification. Skin Appendage Disord. 2018 Jan;4(1):18-24. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  24. Laursen T, Hansen B, Fisker S. Pain perception after subcutaneous injections of media containing different buffers. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2006 Feb;98(2):218-21. PubMed, CrossRef
  25. Yu AW, Leung CB, Li PK, Lui SF, Lai KN. Pain perception following subcutaneous injections of citrate-buffered and phosphate-buffered epoetin alpha. Int J Artif Organs. 1998 Jun;21(6):341-3. PubMed, CrossRef
  26. Gely C, Marin L, Gordillo J, Mañosa M, Bertoletti F, Cañete F, Gonzalez-Muñosa C, Cabré E, Domènech E, Garcia-Planella E. N032 Impact of pain due to subcutaneous administration of a biological drug. J Crohn’s Colitis. 2018; 12(Suppl 1):S582-583.  CrossRef
  27. Fukaya M, Ito A. A New Economic Method for Preparing Platelet-rich Plasma. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014 Jul 9;2(6):e162.  PubMed, PubMed, CrossRef
  28. Biloklytska GF, Kopchak OV, Dieiev VA, Rozdobudko NI. New algorithm of injection PRP-therapy in parodontology. J Educ Health Sport. 2017;7(10):198-206.
  29. Truss NJ, Armstrong PC, Liverani E, Vojnovic I, Warner TD. Heparin but not citrate anticoagulation of blood preserves platelet function for prolonged periods. J Thromb Haemost. 2009 Nov;7(11):1897-905.  PubMed, CrossRef
  30. Greinacher A. Platelet activation by heparin. Blood. 2011 May 5;117(18):4686-7. PubMed, CrossRef
  31. Gao C, Boylan B, Fang J, Wilcox DA, Newman DK, Newman PJ. Heparin promotes platelet responsiveness by potentiating αIIbβ3-mediated outside-in signaling. Blood. 2011 May 5;117(18):4946-52. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  32. Buechler KF, Nakamura KK. More on troponin assays and heparin. Clin Chem. 2001 Jan;47(1):144-7. PubMed
  33. Kramer ME, Keaney TC. Systematic review of platelet-rich plasma (PRP) preparation and composition for the treatment of androgenetic alopecia. J Cosmet Dermatol. 2018 Oct;17(5):666-671. PubMed, CrossRef
  34. Data for biochemical research (third edition) by Dawson RM, Elliott DC, Elliott WH, Jones KM. pp 580. Oxford Science Publications, OUP, Oxford, 1986. ISBN 0‐19‐855358‐7 – Wood – 1987 – Biochemical Education – Wiley Online Library.
  35. Marx RE. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? Implant Dent. 2001;10(4):225-8. PubMed, CrossRef
  36. Oudelaar BW, Peerbooms JC, Huis In ‘t Veld R, Vochteloo AJH. Concentrations of Blood Components in Commercial Platelet-Rich Plasma Separation Systems: A Review of the Literature. Am J Sports Med. 2019 Feb;47(2):479-487. PubMed, CrossRef
  37. Downing SR, Klement GL. Isolation and proteomic analysis of platelets by SELDI-TOF MS. Methods Mol Biol. 2012;818:153-70. PubMed, PubMedCentral, CrossRef

Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.