Tag Archives: поліакриламідний гель
Аналіз профілю молекулярної маси хітозану методом електрофорезу в ступінчастому градієнті пористості поліакриламідного гелю
М. Д. Луцик1*, Н. О. Манько1, Р. О. Білий2,
М. М. Луцик2 (мол.), Р. С. Стойка1
1Інститут біології клітини НАН України, Львів;
2Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
*e-mail: lootsikmaxim@gmail.com
Отримано: 12 квітня 2021; Затверджено: 01 липня 2022
Хітозан є біосумісним і здатним до біодеградації природним біополімером, який широко застосовується у різних галузях біології, медицини і фармації, проте його біологічна дія суттєво залежить від ступеня полімеризації (DP) та ступеня деацетилювання (DDA) полімерних ланцюгів. Оцінка ланцюгів хітозану за показником DP потребує застосування вартісного методу високоефективної ексклюзійної хроматографії (HP-SEC). Метою нашого дослідження було визначення профілю молекулярної маси зразків хітозану шляхом електрофорезу у ступінчастому градієнті пористості поліакриламідного гелю, а також оцінка ефективності цього методу для моніторингу очищення фрагментів хітозану і його похідних. Застосували 2 типи гелів із ступінчастим градієнтом пористості: 1) гель із шарами акриламіду концентрації 2,5; 3,5; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0% w/v для нативного хітозану або його високомолекулярних фрагментів; 2) гель із шарами акриламіду концентрації 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0% w/v для низькомолекулярних фрагментів хітозану. Переважна кількість молекул із пулу хітозану локалізувалась у гелі типу 1 у області 550-40 кДа та розподілялась між трьома бендами, які у різних зразках значно відрізнялись за відсотковим співвідношенням. Електрофорез фрагментів хітозану, фракціонованих із допомогою гель-проникної хроматографії, забезпечував чітке розділення фрагментів середньої молекулярної маси (50-400 кДа) у гелі типу 1 та низькомолекулярних фрагментів (3-40 кДа) у гелі типу 2. Отже, розроблено метод електрофорезу хітозану у ступінчастому градієнті пористості поліакриламідного гелю, який дозволяє охарактеризувати молекулярну масу полімерних ланцюгів у зразках хітозану, а також є ефективним у моніторингу очищення фрагментів хітозану з молекулярною масою в діапазоні від 3 до 400 кДа, отриманих методом гель-проникної хроматографії.
Методи очистки та визначення ензиматичної активності лізилоксидази
О. О. Гудкова, Н. В. Латишко, О. В. Зайцева, С. Г. Шандренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: gudkovahelga@gmail.com
Метою роботи було екстрагування та часткова очистка лізилоксидази, одержаної із тканин гризунів, простим та ефективним методом, а також розробка чутливого методу визначення його активності, який підходить для масштабних лабораторних експериментів in vivo та in vitro. Розроблений метод базується на принципі негативної сорбції полярного гідрофільного адсорбенту каоліну. Активність лізилоксидази оцінювали двома розробленими методами за кількістю пероксиду водню, який утворюється в ході реакції з 1,5-діамінопентаном як субстратом. Н2О2 детектували або за допомогою хемілюмінесценції люмінолу в присутності пероксидази хрону, або флуорометрично з використанням фолієвої кислоти в присутності Cu (II). Застосований метод очистки лізилоксидази із тканин гризунів дозволив позбавитись від 93% баластних протеїнів, що показано за допомогою електрофорезу в ПААГ. Питома активність лізилоксидази після процедури часткового очищення була у 10–24 рази вища, ніж у вихідному екстракті. Молекулярна маса ензиму з тканин мишей становила приблизно 32 кДа. Запропоновані методи дозволяють економити час та матеріали у разі масштабних лабораторних досліджень.