Category Archives: Uncategorized

Конференція молодих вчених «Актуальні аспекти біохімії та біотехнології – 2019»

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, 21-22 березня 2019, Київ

Параметри зсідання плазми крові щурів із гострою променевою хворобою за умов ентеросорбції

В. Чернишенко1, Є. Снежкова2, М. Мазур2, Т. Чернишенко1,
Т. Платонова1, О. Сидоренко2, Е. Луговськой1, В. Ніколаєв2

1Інститут біохімії ім О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ

Радіаційно-індукована коагулопатія (РІК) є однією з основних причин смерті під час гострої променевої хвороби (ГПХ). Метою цієї статті було охарактеризувати реакцію системи гемостазу на ГПХ помірного рівня на 1-шу і 9-ту добу після опромінення, виявити молекулярні маркери системи зсідання крові, які  найбільше постраждали за ГПХ, та оцінити ефект ентеросорбції на розвиток індукованих опроміненням змін. Рівень агрегації тром­боцитів, активований частково тромбопластиновий час (АЧТЧ) і концентрацію фібриногену визначали стандартними методами. Рівень протеїну C (ПС) вимірювали за допомогою хромогенного субстрату S2366 (p-Glu-Pro-Arg-pNa) та ензиму-активатора з отрути Agkistrodon halys halys. Функціонально неактивні форми протромбіну (ФНФП) визначали, використовуючи паралельно два активатори – тромбопластин та активатор протромбіну з отрути Echis multisqumatis. Щури обох опромінених груп мали підвищений ризик внутрішньосудинного зсідання крові порівняно з обома контрольними групами. Виявлено статистично вірогідне скорочення часу зсідання крові в тесті АЧТЧ (24 ± 4 с порівняно з 33 ± 5 с) і підвищення концентрації фібриногену (4,2 ± 0,6 мг/мл порівняно з 3,2 ± 0,3 мг/мл). Обидва параметри нормалізувалися на 9-ту добу після радіаційного опромінення. Однак кількість тромбоцитів зменшувалася (0.3∙106 ± 0.05∙106 1/мкл порівняно з 0.145∙106 ± 0.04∙106 1/мкл) внаслідок порушення функції мегакаріоцитів. Рівень ПС знижувався після опромінення (70 ± 10%) і частково відновлювався на 9-ту добу (87 ± 10%). Введення щурам активованого вугілля (АВ) запобігало зниженню концентрації ПС після опромінення (86 ± 15%) і прискорювало її відновлення на 9-ту добу (103 ± 14%). Статистично вірогідне накопичення ФНФП було виявлено в плазмі крові опромінених щурів (група 1) на обох досліджуваних етапах. ФНФП не були виявлені у жодного з опромінених щурів, які отримували АВ (група 2). Характеристика системи гемостазу щурів, які піддавалися напівлетальній дозі опромінення, дозволила вибрати параметри, які можуть бути використані для моніторингу розвитку ГПХ. Крім основних коагуляційних тестів (АЧТЧ), вивчення агрега­ції тромбоцитів, рівня фібриногену та протеїна С, виявлення ФНФП може бути рекомендованим як дієвий інструмент для оцінки відповіді системи гемостазу на рентгенівське опромінення. Поява ФНФП свідчить про внутрішньосудинне утворення тромбіну і може вказувати на тромботичні ускладнення або дисеміноване внутрішньосудинне зсідання. Визначення ФНФП у плазмі крові опромінених щурів дозволило вивчити ефект ентеросорбції на розвиток змін, спричинених опроміненням. Показано, що ентеросорбція АВ перешкоджає накопиченню ФНФП. Антитромботичний ефект терапії АВ виявлено вперше. Також встановлено, що ГПХ спричинює активацію системи гемостазу, утворення тромбіну (виявлене за рахунок утворення ФНФП), незначне запалення (на що вказує зниження концентрації ПС) і тромбоцитопенію. Ентеросорбція АВ мінімізує запальні та прокоагулянті процеси, спричинені помірною дозою опромінення. Накопичення ФНФП можна вважати одним із найчутливіших маркерів відповіді системи зсідання крові на опромінення.

Взаємодія чотирьох алотропних модифікацій карбонових наночастинок із тканинами організму

С. Я. Парижак1, T. І. Думич1, С. M. Пешкова1,2,
Є. Є. Біла2, О. Д. Луцик1, A. Баррас3,
Р. Букерруб3, С. Сзунерітс3, Р. O. Білий1

1Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
2Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
3Лілльський університет, НЦНД, Центральний Лілль, ВІЕЦТ, Університет Валансьєна, Лілль, Франція;
e-mail: r.bilyy@gmail.com

Забруднення навколишнього середовища та технологічний прогрес призводять до утворення вуглецевих наночастинок, які становлять серйозний ризик для здоров’я. Вони присутні в сажі, пилу, тонері для друку і можуть виникати за шліфування та фрезерування матеріалів. Нейтрофіли людини здатні ізолювати чужорідний матеріал шляхом утворення нейтрофільних позаклітинних пасток (НПП), останні здатні стимулювати сильну запальну відповідь. У роботі було порівняно прозапальні властивості різних наноструктур на основі вуглецю: нанодіамантів, графен оксиду, фулеренів С60 і вуглецевих точок. Було протестовано ад’ювантні властивості вуглецевих наночастинок у моделі імунізації мишей за дослідження гуморальної (специфічні IgG і IgM антитіла) та клітинної (гіперчутливість сповільненого типу) імунної відповіді. Здатність НПП секвеструвати наночастинки вивчено на моделі повітряної кишені мишей, а активацію нейтрофілів перевірено шляхом відстеження флуоресцентно мічених нанодіамантів in vivo, та флуоресцентним аналізом із застосуванням нейтрофілів людини ex vivo. Усі вуглецеві наночастинки виявляли прозапальні ад’ювантні властивості, стимулюючи продукцію специфічних IgG, але не IgM антитіл (гуморальна імунна відповідь). Ад’ювантні властивості зменшувались у порядку від нанодіамантів, графен оксиду, фулеренів С60 до вуглецевих точок. Жодна із досліджуваних вуглецевих наноструктур не спричинювала поя­ву реакції гіперчутливості сповільненого типу (клітинна імунна відповідь). Нанодіаманти і фулерени C60 були секвестровані в організмі НПП, що підтверджено на моделі повітряної кишені, і шляхом відстеження флуоресцентно мічених нанодіамантів in vivo.

Індукція апоптозу у лейкозних клітинах людини за дії нових похідних 2-аміно-5-бензилтіазолу

Н. С. Фінюк1,2, І. І. Івасечко1, O. Ю. Ключівська1, Ю. В. Остап’юк3,
В. П. Гренюх2, Я. Р. Шалай2, В. С. Матійчук3,
M. Д. Обушак3, A. M. Бабський2, Р. С. Стойка1

1Інститут біології клітини НАН України, Львів;
2Львівський національний університет імені Івана Франка, біологічний факультет, Україна;
3Львівський національний університет імені Івана Франка, хімічний факультет, Україна;
e-mail: stoika@cellbiol.lviv.ua

Похідні 2-аміно-5-бензилтіазолу є гетеро­циклічними сполуками, які виявляють різноманітні фармакологічні властивості, в тому числі протипухлинну дію, механізми якої ще недостатньо вивчені. Метою цього дослідження було з’ясування дії двох новосинтезованих похідних тіазолу ‒ 2,8-диметил-7-(3-трифторметил-бензил)піразоло[4,3-е]тіазоло-
[3,2-а]піримідин-4 (2Н)-он (сполука 1) і 7-бензил-8-метил-2-пропілпіразоло[4,3-е] тіазоло[3,2-а]-
піримідин-4(2Н)-он (сполука 2) ‒ на індукцію апоптозу та структуру ДНК у лейкозних клітинах людини. У цій роботі застосовували Вестерн-блот аналіз, ДНК-комет аналіз в лужних умовах, дифеніламіновий метод, ДНК-електрофорез в агарозному гелі, аналіз інтеркаляції ДНК із застосуванням метилового зеленого для вивчення впливу досліджуваних сполук на клітини лейкозу. Встановлено, що ці сполуки активують розщеплення PARP1 і каспази 3, а також збільшення рівня проапоптотичного протеїну Bim та специфічної мітохондріальної нуклеази EndoG, і зниження рівня антиапоптичного протеїну Bcl-2. Дія цих речовин призводить до одноланцюгових розривів у молекулі ДНК і фрагментації ДНК у лейкозних клітинах. Проте ці сполуки не зв’язуються з ДНК і не інтеркалюють у структуру її молекули. Отже, нові похідні 2-аміно-5-бензилтіазолу є потенційними сполуками, які індукують апоптоз у лейкозних клітинах людини.

Приготування висококонцентрованої аутологічної плазми крові, збагаченої тромбоцитами, для біомедичного використання

В. Чернишенко1, К. Штайнберг2, Н. Луговська1, М. Рижикова1,
Т. Платонова1, Д. Корольова1, Е. Луговськой1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2«Клініка доктора Запольскої», Київ, Україна

Клітинна терапія з використанням тромбоцитів є широко поширеним підходом в медицині для загоєння ран і регенерації тканин. Однак, найдоступніші методи дають змогу отримати не достатньо концентровані суспензії тромбоцитів (до 0,3∙106 1/мкл) або суспензії тромбоцитів, що частково або повністю втратили свою активність. У цьому дослідженні ми поставили за мету розробити простий та ефективний метод приготування суспензії нативних та інтактних тромбоцитів у концентрації понад 1∙106 1/мкл. Збагачену тромбоцитами плазму крові (ЗТПК) отримували зі свіжої крові здорових донорів (n = 5), при заборі крові як антикоагулянт використовували гепарин. Зразки ЗТПК осаджували і ресуспендували в аутологічній плазмі крові. Кількість та життєздатність тромбоцитів у кожному зразку визначали шляхом дослідження агрегації на агрегометрі Solar AP2110. Форма тромбоцитів і гранулярність цитоплазми, які вказують на нативність тромбоцитів, контролювали на потоковому цитометрі COULTER EPICS XL. Дослідження агрегації тромбоцитів у ЗТПК, отриманій з використанням різних кількостей гепарину, дозволило нам знизити кінцеві концентрації до кількості, яка ефективно запобігала зсіданню крові і не впливала на активність тромбоцитів (5 U/мл). ЗТПК, сконцентрована в 5 разів із загальною концентрацією клітин 1∙106 1/мкл, була здатна до активації аденозиндифосфатом (AДФ) (ступінь агрегації 54 ± 7%). Кількість клітин зі зміненою формою та гранулярністю в сконцентрованій суспензії не перевищувала 20%. Ці дані свідчать, про те, що тромбоцити зберігають здатність вивільняти ряд факторів росту та інші біологічно активні сполуки після стимуляції або ін’єкції в тканини за клітинної терапії. Зниження концентрації гепарину до того ж мінімізує крововилив в місці ін’єкції, що сприяє біомедичному застосуванню суспензії. Розроблено простий та ефективний метод приготування високо концентрованої ЗТП (1,2∙106 1/мкл) для біомедичного використання. Агрегатометрія і протокова цитометрія довели, що одержані тромбоцити інтактні й здатні активуватися. Препарат, що є аутологічним,  може бути широко використаний для клітинної терапії без додаткових запобіжних заходів.

Прооксидантно-антиоксидантний баланс in vitro та in vivo за дії хіміотерапевтичних засобів на основі 4-тіазолідинону із протипухлинним потенціалом

Л. Кобилінська1, О. Ключівська2, Р. Лесик1, Р. Стойка2

1Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
2Інститут біології клітини НАН України;
e-mail: lesya8@gmail.com

Окислювальний стрес є одним із основних механізмів, за яким протипухлинні хіміотерапевтичні засоби пошкоджують нормальні тканини та органи. У той самий час, він є важливим біохімічним механізмом протипухлинної дії цих препаратів. Метою цього дослідження було визначити прооксидантно–антиоксидантний баланс in vitro та in vivo за дії нових гетероциклічних сполук із протипухлинним потенціалом на основі 4-тіазолідинону. Перевагою використання цих сполук in vivo є їхня низька загальна токсичність порівняно з доксорубіцином. Похідні 4-тіазолідинону (Les-3288, Les-3833, Les-3882) з раніше встановленою антинеопластичною активністю in vitro і протипухлинним ефектом in vivo синтезували, розчиняли у диметилсульфоксиді і вводили внутрішньоочеревинно щурам лінії Вістар щодня протягом 20 днів. Дози введених препаратів відповідали 10% LD50, а саме: доксорубіцин – 5,5 мг/кг, Les-3882 і Les-3833 – 10,7 мг/кг, а Les-3288 – 24,3 мг/кг. Вимірювали радикалпоглинальну активність щодо 1,1-дифеніл-2-пікрилгідразилу (DPPH) в досліджуваних препаратів. Активність ліпопероксидації оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів у тканинах печінки, серця і нирок щурів. Активність супероксиддисмутази, каталази і глутатіонпероксидази визначали в сироватці крові і тканинах щурів. Встановлено, що введення протягом 20 днів сполук Les-3288, Les-3833 і Les-3882 порушує прооксидантно–антиоксидантний баланс у піддослідних щурів. Виявлено зростання концентрації продуктів реакцій пероксидного окислення ліпідів і виснаження ензиматичної антиоксидантної системи в тканинах печінки, серця і нирок. Сполуки Les-3288, Les-3833 і Les-3882 виявляли меншу прооксидантну дію порівняно з ефектом доксорубіцину. За результатами впливу на прооксидантно–антиоксидантний баланс в обраних тканинах досліджувані сполуки можна розмістити таким чином: доксорубіцин >> Les-3833> Les-3288 >> Les-3882. Одержані результати узгоджуються з результатами наших нещодавніх експериментів щодо антинеопластичного ефекту цих похідних in vitro та їх протипухлинної дії in vivo. Також продемонстровано нижчу загальну токсичність їх in vivo порівняно з таким ефектом, показаним раніше для доксорубіцину.

Ефект Сізіфа

Варі Шандор

International Research and Innovation in Medicine Program,
Cedars – Sinai Medical Center, Los Angeles, CA 90048-5502, USA;
e-mail: Sandor.Vari@cshs.org

Внесок лауреатів Нобелівської премії в розвиток динамічної біохімії та біоенергетики. Е. Бухнер, А. Коссель, Р. Вільштеттер, О. Мейєргоф, А. Хілл, О. Варбург, А. Сент-Дьєрді

В. М. Данилова, Р. П. Виноградова, С. В. Комісаренко

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: valdan@biochem.kiev.ua

Дякуючи геніальним відкриттям нобелівських лауреатів першої половини ХХ ст. – Е. Бухнера, А. Косселя, Р. Вільштеттера, О. Мейєргофа, А. Хілла, О. Варбурга, А. Сент-Дьєрді, сьогодні ми маємо уявлення про механізм перетворення і окислення органічних речовин в живих організмах. В статті представлено аналіз творчої діяльності цих геніїв експерименту і людської думки, які через розшифрування основних шляхів перетворення вуглеводів і енергії в живих організмах заклали основи динамічної біохімії та біоенергетики (одного з розділів біохімічної науки).

Вміст регуляторів ангіогенезу та активність ММР-2, -9 у пацієнта з виразкою марторелла

О. М. Петренко1, А. О. Тихомиров2

1Національний медичний університет імені О. О. Богомольця, Київ, Україна;
2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: artem_tykhomyrov@ukr.net

Ішемічні  виразки шкіри ніг хворих на гіпертонічну хворобу (синдром Марторелла) є незвичайною формою хронічних виразок нижніх кінцівок, які виникають на фоні неконтрольованого високого кров’яного тиску. Метою роботи було дослідити вміст протеїнів-регуляторів ангіогенезу (фактора росту ендотеліоцитів судин, або VEGF, та ангіостатинів), а також визначити активність матриксних металопротеїназ (ММР) (желатиназ ММР-2 та -9) у пошкодженій тканині шкіри пацієнта з дворічною історією розвитку виразки Марторелла. Рівні VEGF та ангіостатинів визначали за допомогою імуноблотингу, активність ММР аналізували з використанням желатинової зимографії. Вперше показано, що тканини виразки за синдрому Марторелла характеризуються підвищеним вмістом VEGF (у 75 разів у порівнянні з гістологічно нормальними біоптатами, P < 0,01) та підсиленою продукцією ангіостатинів, які не виявляються у здоровій тканині. Приблизно 10-разове зростання активності ММР-2 та -9 спостерігається у тканині виразки порівняно з неураженою тканиною шкіри. Одержані результати свідчать, що підвищена продукція ангіостатинів може інгібувати проангіогенні ефекти VEGF і, разом із надактивацією ММР, сприяти хронізації ішемічної виразки. Подальшого з’ясування потребують питання, пов’язані з використанням визначення змін профілю регуляторів ангіогенезу та активності протеолітичних систем у клінічній практиці з метою вибору адекватної стратегії лікування хворих із виразкою Марторелла, зокрема хірургічного очищення рани та/або пересадки шкіри.

Оцінка біохімічних показників плазми крові щурів за тетрациклін­індукованого гепатозу та їх коригування фосфоліпідами молока

В. А. Грищенко1, В. В. Мусійчук1, В. О. Чернишенко2,
О. В. Горницька2, Т. М. Платонова2

1Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ;
2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
е-mail: viktoriya_004@ukr.net

Тетрациклін виявляє виражений цитотоксичний ефект на печінку, відтак його широко використовують для тестування терапевтичної ефективності гепатопротекторних препаратів. Метою роботи було визначення біохімічних показників плазми крові щурів та коригувальних властивостей фосфоліпідів молока за тетрациклініндукованого гепатозу. Для моделювання гепатозу щурам щоденно вводили 4%-й розчин тетрацикліну гідрохлориду в дозі 250 мг/кг маси тіла внутрішньошлунково. Корекційну терапію проводили за допомогою 1%-ї суспензії фосфоліпідів молока у формі ліпосомальної біологічно активної добавки «FLP-MD». Експериментальний гепатоз зумовлював вірогідні деструктивні зміни в мембранах гепатоцитів. Це було підтверджено підвищеною амінотрансферазною активністю (зокрема, в плазмі крові активність АСТ зростала у 4,0 раза, АЛТ – в 1,7 раза та їх співвідношення – у 2,4 раза). У щурів із гепатозом відмічено зниження синтезу факторів зсідання крові. Зокрема, вміст фібриногену в плазмі крові на тлі гепатозу знижувався на 21%, протромбіну – на 27,8%, фактора Xa – на 27,9%, протеїну С – на 40,6%. У цих тварин відзначали гіпохромемію як прояв анемії за розвитку гіперазотемії та гіпербілірубінемії. Виявлено порушення фосфорно-кальцієвого обміну та гіперкаліємію. Показано, що введення хворим тваринам фосфоліпідів молока у формі ліпосомальної біологічно активної добавки «FLP-MD» зменшувало прояв негативних ефектів тетрацикліну, про що свідчить відновлення рівня коагуляційних факторів та амінотрансферазної активності. Результати біохімічних досліджень дозволяють рекомендувати «FLP-MD» як засіб гепатопротекції.