Tag Archives: адаптерний протеїн Ruk/CIN85
Калікс[4]аренхалконамід C-1011 має диференційний вплив на життєздатність клітин аденокарциноми молочної залози миші 4T1 з різними рівнями експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85
Л. Г. Бабіч1*, С. Г. Шликов1, О. А. Єсипенко2, А. О. Бавельська-Сьомак1,
А. Г. Загоруйко1, І. Р. Горак1, Л. Б. Дробот1, С. О. Костерін1
1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
*e-mail: babich@biochem.kiev.ua
Отримано: 07 лютого 2021; Затверджено: 01 липня 2022
Згідно з нашими попередніми даними, калікс[4]аренхалконаміди модулюють обмін іонів Ca в мітохондріях міометрія та рівень поляризації внутрішньої мембрани, що потенційно може впливати на життєздатність клітин. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми дослідили вплив калікс[4]арену з 4 халконамідними групами на поляризацію мембрани мітохондрій і життєздатність клітин аденокарциноми молочної залози миші 4T1, сурогатної моделі тричі негативного раку молочної залози людини, а також на його високозлоякісну сублінію з надекспресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85. Мембранний потенціал мітохондрій вимірювали методом проточної цитометрії, а життєздатність клітин оцінювали за допомогою прямого підрахунку з трипановим синім. Показано, що мітохондрійні мембрани контрольних (Mock) клітин мали вищий рівень поляризації (67,80 ± 8,82 в.о., n = 5) порівняно з клітинами 4T1 із надекспресією Ruk/CIN85 (клітини RukUp) (25,42 ± 2,58 в.о., n = 4). Після інкубації клітин із 1 мкМ калікс[4]ареном C-1011 CCCP-чутливий компонент поляризації мітохондрійних мембран зменшився (майже на 50%) у клітинах 4T1 Mock і не змінився у клітинах RukUp порівняно з контролем. Продемонстровано, що 1 мкМ калікс[4]арен C-1011 пригнічував виживаність клітин 4T1 Mock на 45%, але не впливав суттєво на клітини RukUp. Висловлюється припущення, що калікс[4]аренхалконамід С-1011 знижує життєздатність клітин аденокарциноми молочної залози миші 4T1, принаймні, за рахунок впливу на поляризацію мітохондрійних мембран. Отримані дані свідчать про перспективи подальших досліджень калікс[4]аренхалконаміду як потенційного протипухлинного препарату.
Позаклітинні везикули, що продукуються клітинами аденокарциноми грудної залози миші лінії 4Т1 з надекспресією чи пригніченою експресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85, модулюють біологічні відповіді клітин 4Т1 дикого типу в залежний від походження спосіб
А. Ю. Живоложний1,2*, І. Р. Горак1, Д. С. Геращенко1, М. О. Гомозкова3,
О. О. Гудкова1, С. Дж. Вайніо2, А. А. Самойленко2, Л. Б. Дробот1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Факультет біохімії та молекулярної медицини, Університет Оулу, Фінляндія;
3Університет Брігама Янга – Айдахо, Рексбург, США;
*e-mail: ppndl2@gmail.com
Отримано: 02 листопада 2021; Затверджено: 12 листопада 2021
Позаклітинні везикули (ПВ) секретуються більшістю типів клітин як за фізіологічних, так і за патологічних станів, і активно беруть участь в міжклітинній комунікації. Спосіб дії ПВ залежить від їх вмісту. Під час канцерогенезу вони відіграють важливу роль в ініціюванні пухлинного росту, рецидивуванні, метастазуванні й розвитку стійкості до терапії. Маркерні протеїни ПВ Alix і Tsg101, залучені до формування мультивезикулярних тілець (MVPs), а також кортактин, що стимулює секрецію ПВ, є зв’язувальними партнерами адаптерного протеїну Ruk/CIN85. Метою цього дослідження було проаналізувати регуляторні ефекти ПВ, що продукуються клітинами 4Т1 із надекспресією (RukUp) чи пригніченою експресією (RukDown) адаптерного протеїну Ruk/CIN85 на біологічні відповіді (проліферацію, міграційну та інвазійну активності) вихідних клітин 4Т1 WT. ПВ із кондиційованого середовища клітин 4Т1 RukUp або RukDown ізолювали шляхом диференційного центрифугування з подальшим очищенням за допомогою набору Exo-spin™ kit (Cell Guidance Systems). Кількість і розміри ПВ аналізували методом відстеження наночастинок NTA (Malvern Panalytical NanoSight NM300). Вміст маркерних протеїнів і Ruk/CIN85 в ізольованих ПВ аналізували методом Вестерн-блот аналізу. Життєздатність, рухливість і інвазивність клітин 4T1 WT за дії ПВ досліджували за допомогою МТТ-тесту, тесту на заростання подряпини і модифікованої камери Бойдена, відповідно. Вперше продемонстровано, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 є складовим компонентом ПВ, що продукуються клітинами лінії 4Т1. Також, було показано, що ПВ, які продукуються клітинами 4Т1 з різними рівнями експресії Ruk/CIN85, характеризуються специфічними профілями вмісту множинних молекулярних форм цього протеїну. Встановлено, що здатність ПВ модулювати проліферацію, рухливість і інвазивність клітин 4T1 WT in vitro корелює з біологічними властивостями клітин 4Т1, які продукують ПВ (високоінвазивні клітини RukUp або низькоінвазивні клітини RukDown). Одержані дані свідчать про те, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 є не лише складовим компонентом вмісту ПВ, що продукуються аденокарциномними клітинами грудної залози, але й залежно від вмісту в ПВ відіграє активну роль у контролі канцерогенезу.
Вплив адаптерного протеїну Ruk/CIN85 на окисно-відновний потенціал клітин раку грудної залози
І. Р. Горак*, Н. В. Латишко, О. О. Гудкова, Т. О. Кішко,
О. В. Худякова, Д. С. Геращенко, Т. Д. Скатерна,
І. П. Крисюк, С. Г. Шандренко, Л. Б. Дробот
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
*e-mail: iryna.horak@gmail.com
Отримано: 25 лютого 2020; Затверджено: 15 травня 2020
Посилене генерування активних форм кисню (АФК) може призводити до пошкодження клітинних протеїнів, ліпідів і ДНК і навіть спричинити загибель клітин. Наші попередні дослідження показали, що підвищений вміст адаптерного протеїну Ruk/CIN85 призводить до посилення злоякісності клітин раку грудної залози. Метою роботи було дослідити роль Ruk/CIN85 у підтриманні окисно-відновного балансу в ракових клітинах. Як модель було використано клітини аденокарциноми грудної залози миші лінії 4T1 із різними рівнями експресії Ruk/CIN85. Активність каталази (CAT), глутатіонпероксидази (GPx), супероксиддисмутази (SOD), альдегіддегідрогенази (ALDH) та формальдегіддегідрогенази (FALDH), а також вміст H2O2 та альдегідів визначали за допомогою флуорометричних тестів. Кореляції між рівнями експресії Ruk/CIN85 та антиоксидантних ензимів у зразках раку грудної залози аналізували за допомогою транскриптомної бази даних ist.medisapiens. Показано, що клітини 4Т1 із надекспресією Ruk/CIN85 характеризуються підвищеним продукуванням H2O2 та пригніченням активності CAT, GPx і SOD. Надекспресія Ruk/CIN85 супроводжувалась зниженням вмісту альдегідів разом із підвищенням активності ALDH, тоді як у клітинах 4T1 із пригніченням експресії Ruk/CIN85 знижувалась активність ALDH та FALDH. Дані транскриптомного аналізу виявили кореляцію між експресією SH3KBP1 і CAT, GPX4, ALDH1A1, ALDH1L1, ALDH2, GSR, SOD1 у первинних зразках карцином молочної залози людини. Одержані результати свідчать про те, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 бере участь у контролі окисно-відновного балансу клітин аденокарциноми грудної залози миші лінії 4Т1.
Регулювання експресії генів NOX на рівні транскрипції в аденокарциномних клітинах грудної залози людини лінії MCF-7 модулюється за участю адаптерного протеїну Ruk/CIN85
А. В. Базалій, І. Р. Горак, Г. В. Пасічник, С. В. Комісаренко, Л. Б. Дробот
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
e-mail: drobot@biochem.kiev.ua
NADPH оксидази є ключовими компонентами редоксзалежних сигнальних мереж, залучених до контролю проліферації, виживання та інвазії пухлинних клітин. Накопичено дані, які демонструють специфічні профілі та рівні експресії гомологів NADPH оксидаз (NOXs) та їхніх допоміжних протеїнів у лініях пухлинних клітин людини та первинних пухлинах, а також модулювання цих параметрів позаклітинними чинниками. Нашими попередніми дослідженнями виявлено, що продукування АФК аденокарциномними клітинами ободової кишки людини лінії НТ-29 позитивно корелює з рівнем експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85, тоді як підвищені рівні експресії Ruk/CIN85 у слабо інвазивних аденокарциномних клітинах грудної залози людини лінії MCF-7 сприяють розвитку їхнього малігнізованого фенотипу через конститутивну активацію шляху Src/Akt. З метою з’ясування, чи впливає надекспресія Ruk/CIN85 у клітинах MCF-7 на регулювання транскрипції генів NOXs, був проведений скринінг вмісту мРНК NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1, DUOX2 та регуляторної субодиниці p22Phox в субклонах клітин MCF-7 із різними рівнями експресії Ruk/CIN85 за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції (qPCR). Cистемні різноспрямовані зміни рівня мРНК для NOX1, NOX2, NOX5, DUOX2 та p22Phox було виявлено в клітинах MCF-7 із надекспресією адаптерного протеїну порівняно з контрольними клітинами дикого типу. Пригнічення експресії Ruk/CIN85 за допомогою технології РНК-інтерференції призводило до реверсії виявлених змін. З’ясування молекулярних механізмів, що опосередковують вплив Ruk/CIN85 на регулювання транскрипції генів NOXs, потребує подальших досліджень.