Tag Archives: дигітонін
Відмінності в чутливості Na(+),K(+)-ATPази та Mg(2+)-АТРази гладеньких м’язів ободової кишки щура до етанолу та арахідонової кислоти за попередньої обробки клітинних мембран Ds-Na
О. А. Капля
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kaplya@biochem.kiev.ua
Уніфікований методичний підхід дозволяє визначати досить високий рівень функціональної активності Na+,K+-ATPази в неочищеній фракції клітинних мембран гладенького м’яза ободової кишки (ГМОК) щура з використанням стандартної попередньої обробки детергентом (Ds-Na порівняно з дигітоніном). Необхідний обов’язковий поділ етапів: пермеабілізаціі мембран детергентом за оптимального співвідношення детергент/протеїн в умовах захищення активного центру ензиму АТР (для Ds-Na) попередньо до ензиматичної реакції за значного розведення детергенту набагато нижче критичної концентрації міцелоутворення в середовищі АТРази. Високий рівень Na+,K+-АТРазної активності, яка вперше визначена в ГМОК, не відрізнявся для двох детергентів і був порівняним з активністю уабаїн-резистентної Mg2+,АТР-гідролази. Специфічні особливості протеїново-ліпідних комплексів АТРаз оцінювали за чутливістю до мембранотропного впливу етанолу і арахідонової кислоти з різною дезорганізуючою мікрооточення ензимів ефективністю. Довголанцюгова жирна кислота є ефективнішим інгібітором обох АТРаз, ніж аліфатичний спирт. У свою чергу Mg2+,АТР-гідролаза характеризується значно більшою стійкістю до інактивації, ніж Na+,K+-АТРаза в обох випадках. Передбачається можливе існування відмінностей двох ензимних систем у ліпідній залежності як результат особливостей їх структурної організації в мембрані і важливості гідрофобного оточення в механізмі каталізу. Таким чином, застосований простий і надійний підхід визначення активності Na+,K+-АТРази в неочищеній мембранній фракції клітин ГМОК, уніфікований для різних тканин, який може використовуватися в мембранологічних і порівняльних патофізіологічних дослідженнях, а також для тестування впливу різних ефекторів на Na+,K+-АТРазу.
Експериментальне обґрунтування моделі пермеабілізованих гепатоцитів для дослідження дихання мітохондрій in situ
В. М. Мерлавський, Б. О. Манько, О. В. Іккерт, В. В. Манько
Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна
e-mail: vvmanko@lnu.edu.ua
Для експериментального обґрунтування моделі пермеабілізованих гепатоцитів щурів оцінювали ступінь пермеабілізації клітин, використовуючи трипановий тест та їхню швидкість дихання, яку визначали полярографічним методом за окислення ендогенних субстратів – сукцинату (0,35 мМ) та α-кетоглутарату (1 мМ). Окисне фосфорилювання стимулювали ADP (750 мкМ). Ступінь пермеабілізації гепатоцитів дигітоніном залежить як від його концентрації у середовищі, так і кількості клітин у суспензії. За 0,9–1,7 млн. клітин в одному мл суспензії повна пермеабілізація відбувалась за концентрації 25 мкг/мл дигітоніну, за 2,0–3,0 млн. клітин – 50 мкг/мл дигітоніну, а за 4,0–5,6 млн. клітин – 100 мкг/мл дигітоніну. Отже, чим більша густина суспензії клітин, тим більшою має бути концентрація дигітоніну. Обробка гепатоцитів дигітоніном знижувала швидкість ендогенного дихання, яка досягала мінімуму теж за 20–22 мкг дигітоніну на один млн. клітин. Додавання до пермеабілізованих гепатоцитів α-кетоглутарату підтримувало показники дихання на стабільному рівні, вищому за рівень ендогенного дихання за відповідної концентрації дигітоніну, але не інтактних клітин. За одночасного внесення α-кетоглутарату й ADP швидкість дихання пермеабілізованих гепатоцитів збільшувалась до рівня ендогенного дихання інтактних клітин незалежно від концентрації дигітоніну. Внесення у комірку лише сукцинату та особливо сукцинату за наявності ADP значно активувало дихання пермеабілізованих гепатоцитів, яке перевищувало рівень ендогенного дихання інтактних клітин. Залежність швидкості сукцинатстимульованого дихання від концентрації дигітоніну досягала максимуму за 20–22 мкг дигітоніну у розрахунку на один млн. клітин. Передбачається, що оптимальне співвідношення між кількістю дигітоніну і кількістю клітин у суспензії для різних тканин відрізняється.