Ukr.Biochem.J. 2015; Том 87, № 6, листопад-грудень, c. 113-121

doi: http://dx.doi.org/10.15407/ubj87.06.113

Експериментальне обґрунтування моделі пермеабілізованих гепатоцитів для дослідження дихання мітохондрій in situ

06.01.2016   Без категорії   No comments

В. М. Мерлавський, Б. О. Манько, О. В. Іккерт, В. В. Манько

Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна
e-mail: vvmanko@lnu.edu.ua

Для експериментального обґрунтування моделі пермеабілізованих гепатоцитів щурів оцінювали ступінь пермеабілізації клітин, використовуючи трипановий тест та їхню швидкість дихання, яку визначали полярографічним методом за окислення ендогенних субстратів – сукцинату (0,35 мМ) та α-кетоглутарату (1 мМ). Окисне фосфорилювання стимулювали ADP (750 мкМ). Ступінь пермеабілізації гепатоцитів дигітоніном залежить як від його концентрації у середовищі, так і кількості клітин у суспензії. За 0,9–1,7 млн. клітин в одному мл суспензії пов­на пермеабілізація відбувалась за концентрації 25 мкг/мл дигітоніну, за 2,0–3,0 млн. клітин – 50 мкг/мл дигітоніну, а за 4,0–5,6 млн. клітин – 100 мкг/мл дигітоніну. Отже, чим більша густина суспензії клітин, тим більшою має бути концентрація дигітоніну. Обробка гепатоцитів дигітоніном знижувала швидкість ендогенного дихання, яка досягала мінімуму теж за 20–22 мкг дигітоніну на один млн. клітин. Додавання до пермеабілізованих гепатоцитів α-кетоглутарату підтримувало показники дихання на стабільному рівні, вищому за рівень ендогенного дихання за відповідної концентрації дигітоніну, але не інтактних клітин. За одночасного внесення α-кетоглутарату й ADP  швидкість дихання пермеабілізованих гепатоцитів збільшувалась до рівня ендогенного дихання інтактних клітин незалежно від концентрації дигітоніну. Внесення у комірку лише сукцинату та особливо сукцинату за наявності ADP значно активувало дихання пермеабілізованих гепатоцитів, яке перевищувало рівень ендогенного дихання інтактних клітин. Залежність швидкості сукцинатстимульованого дихання від концентрації дигітоніну досягала максимуму за 20–22 мкг дигітоніну у розрахунку на один млн. клітин. Передбачається, що оптимальне співвідношення між кількістю дигітоніну і кількістю клітин у суспензії для різних тканин відрізняється.

Ключові слова: , , , , ,

Посилання:

  1. Chance B, Williams GR. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 1955 Nov;217(1):383-93. PubMed
  2. Dolman NJ, Gerasimenko JV, Gerasimenko OV, Voronina SG, Petersen OH, Tepikin AV. Stable Golgi-mitochondria complexes and formation of Golgi Ca(2+) gradients in pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 2005 Apr 22;280(16):15794-9. PubMed, CrossRef
  3. Rizzuto R, Pozzan T. Microdomains of intracellular Ca2+: molecular determinants and functional consequences. Physiol Rev. 2006 Jan;86(1):369-408. Review. PubMed, CrossRef
  4. Manko VV. Са2+-functional units conception concerning to secretory cell of Chironomus plumosus larvae salivary gland. Studia Biologica. 2008; 2(1): 33-50. (In Ukrainian).
  5. Saks V, Dos Santos P, Gellerich FN, Diolez P. Quantitative studies of enzyme-substrate compartmentation, functional coupling and metabolic channelling in muscle cells. Mol Cell Biochem. 1998 Jul;184(1-2):291-307. PubMed
  6. Park SY, Gifford JR, Andtbacka RH, Trinity JD, Hyngstrom JR, Garten RS, Diakos NA, Ives SJ, Dela F, Larsen S, Drakos S, Richardson RS. Cardiac, skeletal, and smooth muscle mitochondrial respiration: are all mitochondria created equal? Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014 Aug 1;307(3):H346-52. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  7. Holmuhamedov E, Lemasters JJ. Ethanol exposure decreases mitochondrial outer membrane permeability in cultured rat hepatocytes. Arch Biochem Biophys. 2009 Jan 15;481(2):226-33.PubMed, PubMed, CrossRef
  8. Manko BO, Klevets MY, Manko VV. An implication of novel methodology to study pancreatic acinar mitochondria under in situ conditions. Cell Biochem Funct. 2013 Mar;31(2):115-21.  PubMed, CrossRef
  9. Shlykov SG, Babich LG, Kosterin SA. Suspension of smooth muscle cells treated with digitonin as a model for studying the myometrial endoplasmic reticulum calcium pump. Biochemistry (Mosc). 1997 Dec;62(12):1424-8. PubMed
  10. Hulak PV, Dudchenko AM, Zaytsev VV. et al. Hepatocyte: functional-metabolic properties. М.: Nauka, 1985. 272 p. (In Russian).
  11. Hems R, Stubbs M, Krebs HA. Restricted permeability of rat liver for glutamate and succinate. Biochem J. 1968 May;107(6):807-15. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  12. Man’ko BO, Man’ko VV. Influence of Ca2+ on kinetic parameters of pancreatic acinar mitochondria in situ respiration. Ukr Biokhim Zhurn. 2013 Jul-Aug;85(4):48-60. Ukrainian. PubMed, CrossRef
  13. Nishikawa M, Nojima S, Akiyama T, Sankawa U, Inoue K. Interaction of digitonin and its analogs with membrane cholesterol. J Biochem. 1984 Oct;96(4):1231-9. PubMed
  14. Colbeau A, Nachbaur J, Vignais PM. Enzymic characterization and lipid composition of rat liver subcellular membranes. Biochim Biophys Acta. 1971 Dec 3;249(2):462-92. PubMed, CrossRef
  15. Fiskum G, Craig SW, Decker GL, Lehninger AL. The cytoskeleton of digitonin-treated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Jun;77(6):3430-4. PubMed, PubMed, CrossRef
  16. Cook GA, Gattone VH, Evan AP, Harris RA. Structural changes of isolated hepatocytes during treatment with digitonin. Biochim Biophys Acta. 1983 Dec 19;763(4):356-67. PubMed, CrossRef
  17. Meredith MJ, Reed DJ. Status of the mitochondrial pool of glutathione in the isolated hepatocyte. J Biol Chem. 1982 Apr 10;257(7):3747-53. PubMed
  18. Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 1976;13:29-83. Review. PubMed, CrossRef
  19. Gasbarrini A, Borle AB, Farghali H, Bender C, Francavilla A, Van Thiel D. Effect of anoxia on intracellular ATP, Na+i, Ca2+i, Mg2+i, and cytotoxicity in rat hepatocytes. J Biol Chem. 1992 Apr 5;267(10):6654-63. Erratum in: J Biol Chem 1992 Jun 25;267(18):13114. PubMed
  20. Tanaka A, Chance B, Quistorff B. A possible role of inorganic phosphate as a regulator of oxidative phosphorylation in combined urea synthesis and gluconeogenesis in perfused rat liver. A phosphorus magnetic resonance spectroscopy study. J Biol Chem. 1989 Jun 15;264(17):10034-40. PubMed
  21. Wang K, Wondergem R. Hepatocyte water volume and potassium activity during hypotonic stress. J Membr Biol. 1993 Aug;135(2):137-44. PubMed, CrossRef
  22. Zakharchenko MV, Zakharchenko AV, Khunderyakova NV, Tutukina MN, Simonova MA, Vasilieva AA, Romanova OI, Fedotcheva NI, Litvinova EG, Maevsky EI, Zinchenko VP, Berezhnov AV, Morgunov IG, Gulayev AA, Kondrashova MN. Burst of succinate dehydrogenase and α-ketoglutarate dehydrogenase activity in concert with the expression of genes coding for respiratory chain proteins underlies short-term beneficial physiological stress in mitochondria. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Jan;45(1):190-200.  PubMed, CrossRef
Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.