Tag Archives: Na(+)-K(+)-AТРаза
Відмінності в чутливості Na(+),K(+)-ATPази та Mg(2+)-АТРази гладеньких м’язів ободової кишки щура до етанолу та арахідонової кислоти за попередньої обробки клітинних мембран Ds-Na
О. А. Капля
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kaplya@biochem.kiev.ua
Уніфікований методичний підхід дозволяє визначати досить високий рівень функціональної активності Na+,K+-ATPази в неочищеній фракції клітинних мембран гладенького м’яза ободової кишки (ГМОК) щура з використанням стандартної попередньої обробки детергентом (Ds-Na порівняно з дигітоніном). Необхідний обов’язковий поділ етапів: пермеабілізаціі мембран детергентом за оптимального співвідношення детергент/протеїн в умовах захищення активного центру ензиму АТР (для Ds-Na) попередньо до ензиматичної реакції за значного розведення детергенту набагато нижче критичної концентрації міцелоутворення в середовищі АТРази. Високий рівень Na+,K+-АТРазної активності, яка вперше визначена в ГМОК, не відрізнявся для двох детергентів і був порівняним з активністю уабаїн-резистентної Mg2+,АТР-гідролази. Специфічні особливості протеїново-ліпідних комплексів АТРаз оцінювали за чутливістю до мембранотропного впливу етанолу і арахідонової кислоти з різною дезорганізуючою мікрооточення ензимів ефективністю. Довголанцюгова жирна кислота є ефективнішим інгібітором обох АТРаз, ніж аліфатичний спирт. У свою чергу Mg2+,АТР-гідролаза характеризується значно більшою стійкістю до інактивації, ніж Na+,K+-АТРаза в обох випадках. Передбачається можливе існування відмінностей двох ензимних систем у ліпідній залежності як результат особливостей їх структурної організації в мембрані і важливості гідрофобного оточення в механізмі каталізу. Таким чином, застосований простий і надійний підхід визначення активності Na+,K+-АТРази в неочищеній мембранній фракції клітин ГМОК, уніфікований для різних тканин, який може використовуватися в мембранологічних і порівняльних патофізіологічних дослідженнях, а також для тестування впливу різних ефекторів на Na+,K+-АТРазу.
Вплив каліксарену С-107 на кінетичні параметри Nа(+),K(+)-АТР-ази плазматичної мембрани міоцитів матки
Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Р. В. Родік2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@bpci.kiev.ua
В експериментах, виконаних на суспензії перфорованих плазматичних мембран клітин міометрія, досліджували інгібуючу дію каліксарену С-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арен) на кінетичні характеристики Na+,K+-АТР-азної активності.
Показано, що каліксарен С-107, інгібуючи Na+,K+-АТР-азу, не змінює кінетичні параметри залежності швидкості реакції (Km, nH) від концентрації субстрату. Константа активації ензиму хлоридом магнію Kа має складний двофазний характер залежності від концентрації каліксарену С-107 – збільшується вдвічі з ростом концентрації каліксарену С-107 до 50 нМ, а за подальшого підвищення концентрації каліксарену знижується до майже контрольного рівня. При цьому величина коефіцієнта кооперативності Хілла nH активуючої дії MgCl2 практично не змінюється у присутності каліксарену С-107. Як АТР, так і MgCl2 не впливає на константу інгібування Na+,K+-АТР-ази каліксареном С-107, але збільшення концентрації зазначених речовин призводить до зростання коефіцієнта кооперативності nH інгібування АТР-азної реакції каліксареном С-107.
Каліксарен С-107 збільшує спорідненість Nа(+),K(+)-АТР-ази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин до уабаїну
Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Р. В. Родік2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: vik@ioch.kiev.ua
В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, обробленій 0,1%-им розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію каліксарену С-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арен) на Na+,K+-АТР-азну активність.
Доведено, що ця сполука здатна збільшувати спорідненість ензиму до уабаїну: уявна константа інгібування (І0,5) Na+,K+-АТР-ази уабаїном зменшується з 26,9 ± 1,3 мкM дo 10,9 ± 0,6 мкM. Проте сам уабаїн не впливає на спорідненість Na+,K+-АТР-ази до зазначеного калікс[4]арену.
Порівняльне дослідження впливу калікс[4]арену С-99 та його аналогів на Nа(+),K(+)-ATP-азну активність у плазматичній мембрані міоцитів матки
Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, С. О. Черенок2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@ioch.kiev.ua
З метою визначення ролі структурної організації молекули калікс[4]арену С-99 у проявленні інгібіторної дії на Nа+,K+-АТР-азу плазматичних мембран клітин міометрія досліджено дію структурно подібних до нього калікс[4]аренів С-296, С-297, С-424, С-425, С-426, С-427 на активність цього ензиму. Показано, що каліксарени С-296 та С-297 (мають дві додаткові пропокси-групи на нижньому вінці макроциклу) є менш ефективними інгібіторами Na+,K+-АТР-ази порівняно з каліксареном С-99. Каліксарени С-425 та С-427 (мають на верхньому вінці макроциклу відповідно три та чотири залишки фосфонових кислот) також інгібують активність Na+,K+-АТР-ази з нижчою ефективністю порівняно з каліксареном С-99. Каліксарен С-424, в якого на верхньому вінці знаходяться лише два залишки карбонової кислоти, та каліксарен С-426, що містить на верхньому вінці кетометилфосфонові залишки замість гідроксиметилфосфонових залишків у каліксарені С-99, не впливають на активність Nа+,K+-АТР-ази. Зроблено відповідні висновки щодо ролі певних хімічних груп каліксарену С-99 у його взаємодії з Nа+,K+-АТР-азою.
Кінетичні властивості Na(+), K(+)-АТР-ази лімфоцитів крові у хворих на ревматоїдний артрит та анкілозивний спондилоартрит
Р. В. Фафула, У. П. Єфремова, Н. Е. Личковська, З. Д. Воробець
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
е-mail: roman_fafula@ukr.net, vorobets@meduniv.lviv.ua
Проведено аналіз кінетичних властивостей уабаїнчутливої Na+, K+-ATР-ази сапонін-перфорованих лімфоцитів периферичної крові донорів та хворих на ревматоїдний артрит (РА) та анкілозивний спондилоартрит (АСА). За оцінкою змін гідролазної активності Na+, K+-ATР-ази встановлено, що у лімфоцитах крові хворих на РА і АСА первинноактивне транспортування іонів Na+ та K+ відбувається менш інтенсивно у порівнянні з донорами, але має з ними майже однакову ємність. Константа спорідненості Na+, K+-ATР-ази до АТР у лімфоцитах крові хворих на РА і АСА перевищує її значення порівняно з донорами у 3,1 і 2,5 раза відповідно. Показано, що в умовах розвитку ревматичної патології в імунокомпетентних клітинах інгібування активності Na+, K+-ATР-ази відбувається не за рахунок зменшення числа обертів ензиму, а за рахунок зниження спорідненості уабаїнчутливої Na+, K+-ATР-ази до АТР. Водночас, Mg2+-зв’язувальна ділянка уабаїнчутливої Na+, K+-ATР-ази лімфоцитів крові хворих на РА і АСА залишається нативною. Відзначено також, що константа спорідненості Na+, K+-ATР-ази лімфоцитів крові хворих на РА і АСА до іонів Na+ у 2,75 раза нижча її величини у донорів. Досліджено, що Na+, K+-ATР-аза лімфоцитів крові хворих на РА і АСА зберігає свої нативні рецепторні властивості, а її чутливість до інгібування уабаїном не змінюється.
Na(+),K(+)-АТР-аза, ендогенні кардіостероїди та їхня трансдукторна роль
О. В. Цимбалюк1, С. О. Костерін2
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: otsimbal@univ.kiev.ua
Na+,K+-АТР-аза – протеїновий комплекс плазматичної мембрани, який виконує подвійну роль: по-перше, підтримує гомеостаз іонів Na і K, а також трансмембранний градієнт потенціалу і, по-друге, є трансдуктором сигналів і регулятором експресії багатьох ключових генів. Сигнальними молекулами слугують ендогенні кардіотонічні стероїди, які синтезуються в наднирникових залозах та гіпоталамусі. В огляді розглядаються сучасні уявлення про механізми здійснення сигнальної функції Na+,K+-АТР-ази та їх зв’язок із регуляцією клітинних функцій, апоптозу, а також патологіями серцево-судинної системи і водно-сольового гомеостазу.
Калікс[4]арен С-107 як високоафінний супрамолекулярний інгібітор Nа(+),K(+)-ATPази плазматичної мембрани
О. В. Бевза1, Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Р. В. Родік2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: vik@ioch.kiev.ua
В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, досліджували інгібувальну дію 5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арену (калікс[4]арен С-107, наведено шифр) на Na+,K+-АТРазну активність. Показано, що калікс[4]арен С-107 (10-8–10-4 М) ефективніше, ніж уабаїн, пригнічує активність Na+,K+-АТРази, практично не впливаючи на активність базальної Mg2+-АТРази. Величина коефіцієнта інгібування І0,5 дорівнює 33 ± 4 нМ, а значення коефіцієнта Хілла nH – 0,38 ± 0,06. Модельні сполуки: незаміщений за верхнім вінцем 25,27-дипропоксикаліксарен (каліксарен С-150, суто каліксаренова «платформа») (10-8–10-4 М) та N-(4-гідроксифеніл)-2-піридил-амінофосфонова кислота (сполука М-3 – залишок, що модифікує верхній вінець каліксарену С-107 разом із фенольним фрагментом) (10-7–4·10-3 М) практично не впливають на досліджувані ензиматичні системи. Проведено комп’ютерне моделювання взаємодії калікс[4]арену С-107 і його модельних сполук з лігандзв’язувальними ділянками Na+,K+-АТРази плазматичної мембрани. З’ясовано структурні основи міжмолекулярної взаємодії калікс[4]арену С-107 з лігандзв’язувальними ділянками ензиму. Обговорюється участь водневих, гідрофобних, електростатичних і π-π (стекінг)-взаємодій між калікс[4]ареном і амінокислотними залишками Na+,K+-АТРази, і розташовані поруч з активним центром АТРази.
Вплив іонів заліза на активність ATP-гідролаз клітинних мембран гладеньких м’язів ободової кишки та нирок щура
О. А. Капля
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kaplya@biochem.kiev.ua
З метою з’ясування особливостей структурної стійкості АТР-гідролаз у мембрані за дії прооксидантів: Fe2+ і пероксиду водню, а також N-етилмалеїміду (NEM) проведено порівняння Na+,K+-AТРазної активності гладеньких м’язів ободової кишки (ГМОК) з активністю відповідної Mg2+-АТР-гідролази і АТРаз мозкової речовини нирок щурів. Установлено, що за 0,1 мкМ концентрації FeSO4 активність Na+,K+-AТРази ГМОК знижується майже на 30%, а в діапазоні 0,1–10 мкМ – до 45% залишкової активності. За порівняння з ензимом нирок (виключно α1-ізоформа) чутливість Na+,K+-AТРази ГМОК до Fe2+ вірогідно вище за його субмікромолярної концентрації. Mg2+-АТРаза ГМОК значно резистентніша до дії іонів Fe2+, ніж ензим нирок, проте в обох випадках її чутливість значно нижче, ніж відповідної Na+,K+-AТРази. Na+,K+-AТРаза та Mg2+-АТРаза ГМОК і нирок однаково малочутливі до дії пероксиду водню за концентрацій до 1 мМ на тлі 1 мМ ЕГТА. Водночас у присутності 20 мкМ FeSO4 в діапазоні концентрацій Н2О2 1 нМ – 1 мМ Na+,K+-AТРаза інгібується значно більшою мірою, ніж Mg2+-АТРаза. Чутливість до NEM двох АТР-гідролазних систем ГМОК є відповідною до прооксидантної чутливості, що вказує на відмінності в значимості SН-груп для виявлення їхньої функціональної активності. Дійшли висновку, що Na+,K+-AТРаза може слугувати маркером чутливості мембран до окислення, а Mg2+-АТРаза (резистентна до окислення) може бути критерієм окисної резистентності мембранного ензимного комплексу за порівняння з іншими мембранними ензимами, особливо ензимами ГМОК.