Tag Archives: конфокальна мікроскопія
Посилення інтерналізації рекомбінантних фрагментів дифтерійного токсину в чутливих клітинах, опосередковане Т-доменом токсину
К. Ю. Манойлов, А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: manoilovmail@gmail.com
Субодиниця В дифтерійного токсину (ДТ) та її R-домен відрізняються наявністю або відсутністю Т-домена. Метою роботи було проаналізувати взаємодію цих фрагментів токсину з клітинами ссавців для виявлення впливу Т-домену на ендоцитоз у резистентних клітинах. Інтерналізація рекомбінантних флуоресцентних похідних субодиниці В та R-домену була охарактеризована в резистентних клітинах L929, що походять із сполучної тканини миші, та токсинчутливих клітинах Vero з нирок африканської зеленої мавпи. Встановлено, що в процесі інкубації клітин за одночасної присутності субодиниці В та R-домену в культуральному середовищі, клітини Vero інтерналізували більше молекул субодиниці В, ніж R-домену. За таких самих умов клітини L929 інтерналізували більше молекул R-домену, ніж субодиниці В. Колокалізація флуоресцентних субодиниці В та R-домену в клітинах L929 була швидкою та відбувалась практично повністю на ранніх стадіях інкубації порівняно з клітинами Vero, в яких вона була повільна і відбувалась поступово. Одержані дані вказують на те, що Т-домен впливає на інтерналізацію та ендосомальний транспорт ДТ в клітинах відповідно до їхньої чутливості до токсину. Дійшли висновку, що лише в токсинчутливих клітинах Т-домен бере участь у внутрішньоклітинному ендосомальному транспорті та сортуванні ДТ шляхом підсилення інтерналізації молекул токсину.
Побачити – повірити! Конфокальна мікроскопія мікросудин in situ: морфологія, Ca(2+)-сигналізація і тонус
Т. Бурдига, Л. Борисова
Інститут трансляційної медицини, Ліверпульський університет, Велика Британія
Дво- та тривимірна конфокальна мікроскопія дозволяє одержати зображення мікросудин в сечоводі in situ із використанням флуоресцентного Са2+-чутливого зонда Fluo-4. Цей метод дозволив нам продемонструвати виразну морфологію, Са2+-сигналізацію і скоротливу активність міоцитів аркадних артеріол і перицитів аркадних венул. У міоцитах і перицитах Са2+-сигнали виникають виключно за рахунок звільнення із саркоплазматичного ретикулума через інозитол 1,4,5-трифосфатчутливих рецептори. На відміну від міоцитів Са2+ транзієнти в перицитах менш мінливі і э тривалішими. Одержані дані передбачають наявність різних механізмів, які контролюють локальний кровотік в прекапілярних артеріолах і посткапілярних венулах.
Сигнальна функція цитокініну 6-бензиламінопурину в реакції клітин мезофілу Triticum aestivum L. на гіпертермію
М. М. Мусієнко, В. В. Жук, Л. М. Бацманова
ННЦ «Інститут біології», Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Україна;
e-mail: zhuk_bas@voliacable.com
Вивчено сигнальну дію 6-бензиламінопурину (БАП) на клітини листкового мезофілу пшениці в умовах гіпертермії. Встановлено, що БАП за дії гіпертермії регулює вміст фотосинтетичних пігментів, пероксиду водню, активність антиоксидантних ензимів – супероксиддисмутази, аскорбатпероксидази, каталази. Продемонстрована адитивна дія БАП та гіпертермії на активацію антиоксидантних систем клітин. БАП регулює відновні процеси в клітинах листкового мезофілу пшениці в умовах високотемпературного стресу.
Вплив Т-домену дифтерійного токсину на pН ендосом
А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: lab.andrey@gmail.com
Ключовим етапом у реалізації цитотоксичної дії дифтерійного токсину (ДТ) є перенесення його каталітичного домену (Сd) з ендосом у цитозоль. Головну роль у цьому процесі відіграє транспортний домен (Тd), проте молекулярний механізм його функціонування залишається невідомим. Раніше нами було показано, що Тd здатний впливати на ендосомальний транспорт ДТ. Метою цієї роботи було вивчення впливу Тd дифтерійного токсину на компартменталізацію ендосом і на рН ендосомального середовища. Для цього ми використовували рекомбінантні фрагменти ДТ, які відрізнялися лише наявністю Тd в їхньому складі, що були злиті із флуоресцентними протеїнами. Показано, що фрагмент токсину із Td повільніше проходив шлях ранні–пізні ендосоми–лізосоми, та мав дещо відмінну від фрагмента ДТ (без Td) колокалізацію з ендосомальними маркерами. При цьому з 10- до 50-ї хв спостереження рН ендосом, що містять фрагменти ДТ із Тd, мали стале значення рН (~ 6,5). За цей час для ендосом, що містять фрагменти ДТ без Тd, продемонстровано зниження рН від 6,3 до 5,5. Одержані результати вказують на те, що Td інгібує закислення ендосомального середовища. Однією з можливих причин цього може бути вплив утвореного Т-доменом іонного каналу на процес зниження рН ендосом. Ця властивість Td може не тільки сповільнювати дозрівання ендосом, але і пригнічувати активацію рН-залежних ендосомальних протеїназ, що сприяє успішному транспортуванню Cd у цитозоль клітини.
Роль Т-домену дифтерійного токсину у внутрішньоклітинному транспортуванні токсинвмісних везикул
А. Ю. Лабинцев, Д. В. Колибо, Є. С. Юрченко,
А. А. Кабернюк, Н. В. Короткевич, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Кїв;
е-mail: lab.andrey@gmail.com
Субодиниця В дифтерійного токсину (ДТ), яка складається із двох доменів, R – рецепторного та Т – трансмембранного, відіграє важливу роль у зв’язуванні токсину з рецептором на клітинах-мішенях та у транспортуванні каталітичної субодиниці А до цитозолю. Рекомбінантні аналоги субодиниці В є перспективними представниками унікального класу транспортувальних протеїнів, які здатні забезпечити доставку біологічно активних молекул до цитозолю клітин. Створення таких конструкцій вимагає з’ясування ролі кожного із фрагментів ДТ у транспортуванні комплексу рецептор–токсин.
У роботі досліджували роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні рекомбінантних фрагментів ДТ. Для цього порівнювали особливості внутрішньоклітинного транспортування R-домену та субодиниці В, яка містить в собі як R-, так і Т-домен. Рекомбінантні фрагменти ДТ мітили флуоресцентними протеїнами, що дозволило використовувати в дослідженні техніку колокалізації. Методом конфокальної мікроскопії встановлено відмінності у транспортуванні рекомбінантних похідних ДТ у клітинах лінії Vero. Показано, що R-домен швидше потрапляє до тубулярних компартментів клітини, ніж субодиниця В. Аналіз колокалізації R-домену та субодиниці В підтверджує майже лінійне її зростання за коефіцієнтом Пірсона (PCC) у разі збільшення часу інкубації. Проте відсоток субодиниці В, колокалізованої з R-доменом, визначений за коефіцієнтом Мандерса (M1), зростає нелінійно, що може свідчити про здатність субодиниці В потрапляти до певних компартментів клітини, недоступних для R-домену. Роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні та компартменталізації токсину, вірогідно, пов’язана з його здатністю до формування протонних каналів та взаємодії з комплексом протеїнів цитоплазми COPI.
Модуляція мембранного потенціалу мітохондрій міометрія антагоністами кальмодуліну
С. Г. Шликов, Л. Г. Бабіч, М. Є. Євтушенко, С. О. Карахім, С. О. Костерін
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: sshlykov@biochem.kiev.ua
Вплив антагоністів кальмодуліну – кальмідазоліуму та трифлуоперазину – на мембранний потенціал мітохондрій досліджували із використанням методів проточної цитометрії, конфокальної мікроскопії та залученням потенціалчутливих флуоресцентних зондів MTG та ТМRM. Вивчення впливу різних концентрацій антагоністів кальмодуліну на мембранний потенціал мітохондрій виконували на проточному цитометрі з використанням фракції ізольованих мітохондрій міометрія невагітних щурів. Встановлено, що кальмідазоліум у концентрації від 1 до 10 мкМ дозозалежно знижує мембранний потенціал мітохондрій. У той же час, трифлуоперазин у концентрації від 10 до 100 мкМ діє різним чином: 10 мкМ – збільшує поляризацію, тоді як 100 мкМ спричинює майже повну деполяризацію мітохондріальних мембран. Методом конфокальної мікроскопії на клітинах міометрія продемонстровано, що внесення в середовище інкубації MTG приводить до появи флуоресценції в «зеленому» діапазоні випромінювання. Додавання іншого зонда – ТМRM – зумовлює флуоресценцію в «червоному» діапазоні випромінювання. Деполяризація мітохондрій протонофором СССР та 10 мМ NaN3 супроводжується зниженням інтенсивності «червоної» флуоресценції, при цьому «зелена» флуоресценція зберігається. Внесення в середовище інкубації 10 мкМ кальмідазоліуму або 100 мкМ трифлуоперазину супроводжується після 10–15 хв інкубації практично повним гасінням флуоресцентного сигналу зонда TMRM. Таким чином, із використанням потенціалчутливих флуоресцентних зондів TMRM та MTG продемонстровано, що антагоністи кальмодуліну модулюють мембранний потенціал мітохондрій клітин міометрія.