Tag Archives: ендоцитоз
Роль гепаринзв’язувального домену у внутрішньоклітинному трафіку sHB-EGF
О. І. Криніна, К. Ю. Манойлов, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: olyakrynina@gmail.com
Отримано: 11 липня 2018; Затверджено: 17 травня 2019
Гепаринзв’язувальний EGF-подібний фактор росту (HB-EGF) є представником сімейства епідермальних факторів росту, який є потужним мітогеном та атрактантом. HB-EGF-опосередкована активація EGFR є необхідною для стимуляції експресії генів, міграції та проліферації клітин як за нормальних, так і патогенних фізіологічних процесів. Основна мета цього дослідження полягала у визначенні ролі гепаринзв’язувального домену HB-EGF у процесі формування стабільного рецептор-лігандного комплексу та його подальшої інтерналізації до цитоплазми. Було використано флуоресцентно-мічене рекомбінантне похідне розчинного HB-EGF та його вкорочену форму (sHB-EGFΔ84-106) з делецією гепаринзв’язувального домену. Спочатку, з використанням протокової цитофлуориметрії, було визначено кінетику зв’язування двох форм sHB-EGF до його рецепторів на поверхні клітин. Для дослідження впливу відсутності гепаринзв’язувального домену в структурі HB-EGF на його інтерналізацію проаналізовано процес ендоцитозу EGFP-sHB-EGFΔ84-106 та EGFP-sHB-EGF за допомогою конфокальної мікроскопії. Виявлено, що повнорозмірна форма HB-EGF характеризується меншою інтенсивністю транслокації до цитоплазми порівняно з вкороченою формою sHB-EGF. Таким чином, відмінності у транспортуванні повнорозмірної або вкороченої форми sHB-EGF до клітинної цитоплазми можуть відображати механізми впливу позаклітинного матриксу на прояв біологічної активності sHB-EGF.
Вплив Т-домену дифтерійного токсину на pН ендосом
А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: lab.andrey@gmail.com
Ключовим етапом у реалізації цитотоксичної дії дифтерійного токсину (ДТ) є перенесення його каталітичного домену (Сd) з ендосом у цитозоль. Головну роль у цьому процесі відіграє транспортний домен (Тd), проте молекулярний механізм його функціонування залишається невідомим. Раніше нами було показано, що Тd здатний впливати на ендосомальний транспорт ДТ. Метою цієї роботи було вивчення впливу Тd дифтерійного токсину на компартменталізацію ендосом і на рН ендосомального середовища. Для цього ми використовували рекомбінантні фрагменти ДТ, які відрізнялися лише наявністю Тd в їхньому складі, що були злиті із флуоресцентними протеїнами. Показано, що фрагмент токсину із Td повільніше проходив шлях ранні–пізні ендосоми–лізосоми, та мав дещо відмінну від фрагмента ДТ (без Td) колокалізацію з ендосомальними маркерами. При цьому з 10- до 50-ї хв спостереження рН ендосом, що містять фрагменти ДТ із Тd, мали стале значення рН (~ 6,5). За цей час для ендосом, що містять фрагменти ДТ без Тd, продемонстровано зниження рН від 6,3 до 5,5. Одержані результати вказують на те, що Td інгібує закислення ендосомального середовища. Однією з можливих причин цього може бути вплив утвореного Т-доменом іонного каналу на процес зниження рН ендосом. Ця властивість Td може не тільки сповільнювати дозрівання ендосом, але і пригнічувати активацію рН-залежних ендосомальних протеїназ, що сприяє успішному транспортуванню Cd у цитозоль клітини.
Роль Т-домену дифтерійного токсину у внутрішньоклітинному транспортуванні токсинвмісних везикул
А. Ю. Лабинцев, Д. В. Колибо, Є. С. Юрченко,
А. А. Кабернюк, Н. В. Короткевич, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Кїв;
е-mail: lab.andrey@gmail.com
Субодиниця В дифтерійного токсину (ДТ), яка складається із двох доменів, R – рецепторного та Т – трансмембранного, відіграє важливу роль у зв’язуванні токсину з рецептором на клітинах-мішенях та у транспортуванні каталітичної субодиниці А до цитозолю. Рекомбінантні аналоги субодиниці В є перспективними представниками унікального класу транспортувальних протеїнів, які здатні забезпечити доставку біологічно активних молекул до цитозолю клітин. Створення таких конструкцій вимагає з’ясування ролі кожного із фрагментів ДТ у транспортуванні комплексу рецептор–токсин.
У роботі досліджували роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні рекомбінантних фрагментів ДТ. Для цього порівнювали особливості внутрішньоклітинного транспортування R-домену та субодиниці В, яка містить в собі як R-, так і Т-домен. Рекомбінантні фрагменти ДТ мітили флуоресцентними протеїнами, що дозволило використовувати в дослідженні техніку колокалізації. Методом конфокальної мікроскопії встановлено відмінності у транспортуванні рекомбінантних похідних ДТ у клітинах лінії Vero. Показано, що R-домен швидше потрапляє до тубулярних компартментів клітини, ніж субодиниця В. Аналіз колокалізації R-домену та субодиниці В підтверджує майже лінійне її зростання за коефіцієнтом Пірсона (PCC) у разі збільшення часу інкубації. Проте відсоток субодиниці В, колокалізованої з R-доменом, визначений за коефіцієнтом Мандерса (M1), зростає нелінійно, що може свідчити про здатність субодиниці В потрапляти до певних компартментів клітини, недоступних для R-домену. Роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні та компартменталізації токсину, вірогідно, пов’язана з його здатністю до формування протонних каналів та взаємодії з комплексом протеїнів цитоплазми COPI.