Tag Archives: Hansenula рolymorpha

Клонування і функціональний аналіз GSH1/MET1 гену, що комплементує ауксотрофність за цистеїном та глутатіоном у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha

В. М. Убийвовк1 , О. В. Блаженко1, М. Ціммерманн2, M. Дж. Согн3,4, Н. А. Канг3,4

1Інститут біології клітини НАН України, Львів;
2Інститут біології IV- Мікробіологія і генетика- RWTH Аахен, Німеччина;
3Корейський науково-дослідний інститут біологічних наук та біотехнології, Даеджон, Корея;
4Відділ наук про життя,  Чунг-Анг університет, Сеул, Корея;
e-mail: Oleksandra.Blazhenko@googlemail.com

Ген GSH1/MET1 Hansenula polymorpha клонували шляхом комплементації глутатіонзалежного росту мутанта gsh1 H. polymorpha, попередньо виділеного як клон, що виявляв резистентність до N-метил-N′-нітро-N-нітрозогуанідину (MNNG) і чутливість до іонів кадмію. Ген GSH1 H. polymorpha відновлював резистентність до іонів кадмію, чутливість до MNNG, нормальний рівень глутатіону та проліферацію клітин на мінімальному середовищі без додавання цистеїну або глутатіону за введення у клітини мутанта gsh1. Показано, що ген GSH1 H. polymorpha є гомологічним гену MET1 Saccharomyces cerevisiae, що кодує S-аденозил-L-метіонін уропорфіриноген III трансметилазу, яка відповідає за біосинтез кофактора сульфітредуктази, сірогему. Нами була сконструйована касета з делецією гену GSH1/MET1 H. polymorpha (Hpgsh1/met1::ScLEU2) та одержані відповідні нуль-мутанти (із делецією значної частини структурної ділянки цього гену). Дані зі схрещування точкового gsh1 мутанта та нуль-мутантів за gsh1/met1 продемонстрували, що обидві алелі розміщені в одному й тому ж гені. Нуль-мутант за gsh1/met1  повністю відновлював ріст на мінімальному середовищі із цистеїном або глутатіоном як єдиному джерелі сірки, але не з неорганічними (сульфат, сульфіт) чи органічними (метіонін, S-аденозилметіонін) джерелами сірки. Окрім того, обидва мутанти – точковий gsh1 і нуль-мутант за gsh1/met1 – виявляли підвищену чутливість до токсичного вуглецевого субстрату метанолу, до формальдегіду, органічного пероксиду та іонів кадмію.

Транскрипційна регуляція гену GSH2 Hansenula polymorpha у відповідь на дію іонів кадмію

О. В. Блаженко, А. Б. Котлярчук, В. М. Убийвовк

Інститут біології клітини НАН України, Львів;
e-mail: Oleksandra.Blazhenko@googlemail.com

Попередньо нами було клоновано ген GSH2, що кодує γ-глутамілцистеїнсинтетазу (γGCS) у дріжджів Hansenula рolymorpha. У цій роботі проведено аналіз молекулярної організації промотору гену GSH2 H. рolymorpha і виявлено ймовірні сайти зв’язування транскрипційних факторів Yap1, Skn7, Creb/Atf1 та Cbf1. З’ясовано, що для повноцінної регуляції експресії гену GSH2 у відповідь на кадмієвий та оксидативний стрес необхідна довжина промотору GSH2 більша за 450 п.н. від початку ініціації трансляції. Для дослідження транскрипційної регуляції гену GSH2 H. polymorpha сконструйовано рекомбінантний штам, що містить репортерну касету, в якій регуляторна ділянка гену GSH2 розміром 1,832 т.п.н. злита зі структурною та термінаторною ділянками гену алкогольоксидази. Показано, що транскрипція гену GSH2 H. polymorpha максимально підвищується на 33% в багатому середовищі за 4-годинної інкубації з концентрацією іонів кадмію 1 мкМ. У мінімальному середовищі експресія гену GSH2 не корелює з підвищенням рівнів загального клітинного глутатіону за дії іонів кадмію. Висловлено припущення, що підвищення вмісту загального клітинного глутатіону за кадмієвого стресу у дріжджів H. polymorpha ймовірно не контролюється на рівні транскрипції гену GSH2.