Ukr.Biochem.J. 2014; Том 86, №4, липень-серпень, c. 69-78

doi: http://dx.doi.org/10.15407/ubj86.04.069

Клітинна модель для дослідження рецепторної та регуляторної функцій proHB-EGF людини

Н. В. Короткевич, А. Ю. Лабинцев, К. Ю. Манойлов, О. І. Криніна,
Л. В. Дяченко, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: gnr.nata@gmail.com

Дослідження внутрішньоклітинних шляхів транспортування proHB-EGF, а також його ліганд-рецепторних комплексів, вимагає створення новітніх підходів та моделей, зокрема, із застосуванням флуоресцентних технік. З метою створення моделі для вивчення функцій proHB-EGF було одержано генетичну конструкцію pEGFP-N1-proHB-EGF, що кодує протеїн proHB-EGF-EGFP–proHB-EGF, злитий з посиленим зеленим флуоресцентним протеїном EGFP на цитоплазматичному кінці молекули. Шляхом трансфекції pEGFP-N1-proHB-EGF одержано евкаріотичні клітини ліній Vero, які експресували на поверхні злитий протеїн proHB-EGF-EGFP. Експресований у клітинах Vero proHB-EGF-EGFP зв’язував нетоксичне флуоресцентне похідне рецепторної субодиниці В дифтерійного токсину mCherry-SubB. Після стимуляції трансфекованих клітин ТРА (12-0-тетра-деканоїлфорбол-13-ацетат), proHB-EGF-EGFP утворював флуоресцентно-мічений С-термінальний фрагмент молекули – CTF-EGFP. Отже, одержана генетична конструкція pEGFP-N1-proHB-EGF дозволяє візуалізувати молекули proHB-EGF та CTF у клітинах. Це відкриває нові можливості для дослідження їхніх функцій, зокрема рецепторної функції proHB-EGF при зв’язуванні з молекулою дифтерійного токсину, досліджень внутрішньоклітинних шляхів транспортування CTF та пошуку природних лігандів для proHB-EGF.

Ключові слова: , , ,


Посилання:

  1. Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, Fiddes JC, Klagsbrun M. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF. Science. 1991 Feb 22;251(4996):936-9. PubMed, CrossRef
  2. Raab G, Klagsbrun M. Heparin-binding EGF-like growth factor. Biochim Biophys Acta. 1997 Dec 9;1333(3):F179-99. Review. PubMed
  3. Higashiyama S, Nanba D. ADAM-mediated ectodomain shedding of HB-EGF in receptor cross-talk. Biochim Biophys Acta. 2005 Aug 1;1751(1):110-7. Review. PubMed, CrossRef
  4. Hieda M, Isokane M, Koizumi M, Higashi C, Tachibana T, Shudou M, Taguchi T, Hieda Y, Higashiyama S. Membrane-anchored growth factor, HB-EGF, on the cell surface targeted to the inner nuclear membrane. J Cell Biol. 2008 Feb 25;180(4):763-9. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  5. Higashiyama S, Iwabuki H, Morimoto C, Hieda M, Inoue H, Matsushita N. Membrane-anchored growth factors, the epidermal growth factor family: beyond receptor ligands. Cancer Sci. 2008 Feb;99(2):214-20. Review. PubMed, CrossRef
  6. Harris RC, Chung E, Coffey RJ. EGF receptor ligands. Exp Cell Res. 2003 Mar 10;284(1):2-13. Review. PubMed, CrossRef
  7. Naglich JG, Metherall JE, Russel DW, Eidels L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth precursor. Cell. 1992 Jun;69(6):1051–61. PubMedCrossRef
  8. Lord JM, Smith DC, Roberts LM. Toxin entry: how bacterial proteins get into mammalian cells. Cell Microbiol. 1999 Sep;1(2):85-91. Review. PubMed, CrossRef
  9. Kaberniuk AA, Labyntsev AJ Kolibo DV, Oliinyk OS., Redchuk TA, Korotkevich NV, Horchev VF, Karahim SO, Komisarenko SV. Fluorescent derivatives of diphtheria toxin subunit B and their interaction with Vero cells.  Ukr Biokhim Zhurn. 2009 Jan-Feb;81(1):67-77. Ukrainian. PubMed
  10. Korotkevich NV, Labyntsev AJ, Kaber­niuk AA, Oliinyk OS, Romanyuk SI, Kolibo DV, Komisarenko SV. Cytotoxicity of the B subunit of diphtheria toxin to human histocytic lymphoma U937. Ukr Biokhim Zhurn. 2009 Jul-Aug;81(4):69-80. Ukrainian. PubMed
  11. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harb. Lab. Press, 1989. A1.2–A2.12.
  12. Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1998 Jul;16)(13):6127–6145. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  13. Korotkevich NV, Kolibo DV, Labyntsev А Ju, Romaniuk SІ, Komisarenko SV. Obtaining of recombinant human heparin-binding EGF-like growth factor and perspectives of its application in biotechnology. Biotechnology. 2010;3(4):44-54. (In Ukrainian).
  14. Dethlefsen SM, Raab G, Moses M A, Adam RM, Klagsbrun M, Freeman MR. Extracellular calcium influx stimulates metalloproteinase cleavage and secretion of heparin-binding EGF-like growth factor independently of protein kinase C. J Cell Biochem. 1998 May;69(2):143–153.  PubMed, CrossRef
  15. Simpson JC, Smith DC, Roberts LM, Lord JM. Expression of mutant dynamin protects cells against diphtheria toxin but not against ricin. Exp Cell Res. 1998 Mar 15;239(2):293-300. PubMed, CrossRef

Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.