Tag Archives: дифтерійний токсин
Посилення інтерналізації рекомбінантних фрагментів дифтерійного токсину в чутливих клітинах, опосередковане Т-доменом токсину
К. Ю. Манойлов, А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: manoilovmail@gmail.com
Субодиниця В дифтерійного токсину (ДТ) та її R-домен відрізняються наявністю або відсутністю Т-домена. Метою роботи було проаналізувати взаємодію цих фрагментів токсину з клітинами ссавців для виявлення впливу Т-домену на ендоцитоз у резистентних клітинах. Інтерналізація рекомбінантних флуоресцентних похідних субодиниці В та R-домену була охарактеризована в резистентних клітинах L929, що походять із сполучної тканини миші, та токсинчутливих клітинах Vero з нирок африканської зеленої мавпи. Встановлено, що в процесі інкубації клітин за одночасної присутності субодиниці В та R-домену в культуральному середовищі, клітини Vero інтерналізували більше молекул субодиниці В, ніж R-домену. За таких самих умов клітини L929 інтерналізували більше молекул R-домену, ніж субодиниці В. Колокалізація флуоресцентних субодиниці В та R-домену в клітинах L929 була швидкою та відбувалась практично повністю на ранніх стадіях інкубації порівняно з клітинами Vero, в яких вона була повільна і відбувалась поступово. Одержані дані вказують на те, що Т-домен впливає на інтерналізацію та ендосомальний транспорт ДТ в клітинах відповідно до їхньої чутливості до токсину. Дійшли висновку, що лише в токсинчутливих клітинах Т-домен бере участь у внутрішньоклітинному ендосомальному транспорті та сортуванні ДТ шляхом підсилення інтерналізації молекул токсину.
Вплив Т-домену дифтерійного токсину на pН ендосом
А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: lab.andrey@gmail.com
Ключовим етапом у реалізації цитотоксичної дії дифтерійного токсину (ДТ) є перенесення його каталітичного домену (Сd) з ендосом у цитозоль. Головну роль у цьому процесі відіграє транспортний домен (Тd), проте молекулярний механізм його функціонування залишається невідомим. Раніше нами було показано, що Тd здатний впливати на ендосомальний транспорт ДТ. Метою цієї роботи було вивчення впливу Тd дифтерійного токсину на компартменталізацію ендосом і на рН ендосомального середовища. Для цього ми використовували рекомбінантні фрагменти ДТ, які відрізнялися лише наявністю Тd в їхньому складі, що були злиті із флуоресцентними протеїнами. Показано, що фрагмент токсину із Td повільніше проходив шлях ранні–пізні ендосоми–лізосоми, та мав дещо відмінну від фрагмента ДТ (без Td) колокалізацію з ендосомальними маркерами. При цьому з 10- до 50-ї хв спостереження рН ендосом, що містять фрагменти ДТ із Тd, мали стале значення рН (~ 6,5). За цей час для ендосом, що містять фрагменти ДТ без Тd, продемонстровано зниження рН від 6,3 до 5,5. Одержані результати вказують на те, що Td інгібує закислення ендосомального середовища. Однією з можливих причин цього може бути вплив утвореного Т-доменом іонного каналу на процес зниження рН ендосом. Ця властивість Td може не тільки сповільнювати дозрівання ендосом, але і пригнічувати активацію рН-залежних ендосомальних протеїназ, що сприяє успішному транспортуванню Cd у цитозоль клітини.
Клітинна модель для дослідження рецепторної та регуляторної функцій proHB-EGF людини
Н. В. Короткевич, А. Ю. Лабинцев, К. Ю. Манойлов, О. І. Криніна,
Л. В. Дяченко, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: gnr.nata@gmail.com
Дослідження внутрішньоклітинних шляхів транспортування proHB-EGF, а також його ліганд-рецепторних комплексів, вимагає створення новітніх підходів та моделей, зокрема, із застосуванням флуоресцентних технік. З метою створення моделі для вивчення функцій proHB-EGF було одержано генетичну конструкцію pEGFP-N1-proHB-EGF, що кодує протеїн proHB-EGF-EGFP–proHB-EGF, злитий з посиленим зеленим флуоресцентним протеїном EGFP на цитоплазматичному кінці молекули. Шляхом трансфекції pEGFP-N1-proHB-EGF одержано евкаріотичні клітини ліній Vero, які експресували на поверхні злитий протеїн proHB-EGF-EGFP. Експресований у клітинах Vero proHB-EGF-EGFP зв’язував нетоксичне флуоресцентне похідне рецепторної субодиниці В дифтерійного токсину mCherry-SubB. Після стимуляції трансфекованих клітин ТРА (12-0-тетра-деканоїлфорбол-13-ацетат), proHB-EGF-EGFP утворював флуоресцентно-мічений С-термінальний фрагмент молекули – CTF-EGFP. Отже, одержана генетична конструкція pEGFP-N1-proHB-EGF дозволяє візуалізувати молекули proHB-EGF та CTF у клітинах. Це відкриває нові можливості для дослідження їхніх функцій, зокрема рецепторної функції proHB-EGF при зв’язуванні з молекулою дифтерійного токсину, досліджень внутрішньоклітинних шляхів транспортування CTF та пошуку природних лігандів для proHB-EGF.
Роль Т-домену дифтерійного токсину у внутрішньоклітинному транспортуванні токсинвмісних везикул
А. Ю. Лабинцев, Д. В. Колибо, Є. С. Юрченко,
А. А. Кабернюк, Н. В. Короткевич, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Кїв;
е-mail: lab.andrey@gmail.com
Субодиниця В дифтерійного токсину (ДТ), яка складається із двох доменів, R – рецепторного та Т – трансмембранного, відіграє важливу роль у зв’язуванні токсину з рецептором на клітинах-мішенях та у транспортуванні каталітичної субодиниці А до цитозолю. Рекомбінантні аналоги субодиниці В є перспективними представниками унікального класу транспортувальних протеїнів, які здатні забезпечити доставку біологічно активних молекул до цитозолю клітин. Створення таких конструкцій вимагає з’ясування ролі кожного із фрагментів ДТ у транспортуванні комплексу рецептор–токсин.
У роботі досліджували роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні рекомбінантних фрагментів ДТ. Для цього порівнювали особливості внутрішньоклітинного транспортування R-домену та субодиниці В, яка містить в собі як R-, так і Т-домен. Рекомбінантні фрагменти ДТ мітили флуоресцентними протеїнами, що дозволило використовувати в дослідженні техніку колокалізації. Методом конфокальної мікроскопії встановлено відмінності у транспортуванні рекомбінантних похідних ДТ у клітинах лінії Vero. Показано, що R-домен швидше потрапляє до тубулярних компартментів клітини, ніж субодиниця В. Аналіз колокалізації R-домену та субодиниці В підтверджує майже лінійне її зростання за коефіцієнтом Пірсона (PCC) у разі збільшення часу інкубації. Проте відсоток субодиниці В, колокалізованої з R-доменом, визначений за коефіцієнтом Мандерса (M1), зростає нелінійно, що може свідчити про здатність субодиниці В потрапляти до певних компартментів клітини, недоступних для R-домену. Роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні та компартменталізації токсину, вірогідно, пов’язана з його здатністю до формування протонних каналів та взаємодії з комплексом протеїнів цитоплазми COPI.