Category Archives: Uncategorized
Адаптаційна відповідь ацинарних клітин підшлункової залози щурів на деполяризацію внутрішньої мембрани мітохондрій
Б. О. Манько, О. О. Білонога, В. В. Манько
Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
e-mail: bohdan.manko@lnu.edu.ua
Отримано: 06 грудня 2018; Затверджено: 14 березня 2019
Залежність роз’єднаного дихання інтактних панкреатичних ацинусів від субстратів окислення та функціонального стану клітини не досліджено. У роботі реєстрували базальну швидкість та швидкість FCCP-стимульованого дихання ізольованих панкреатичних ацинусів за допомогою електрода Кларка і оцінювали мембранний потенціал мітохондрій за інтенсивністю флуоресценції родаміну 123. Відповідь ацинусів на внесення FCCP характеризували максимальною швидкістю роз’єднаного дихання, оптимальною концентрацією FCCP, прискоренням та сповільненням дихання. Максимальна швидкість роз’єднаного дихання істотно збільшилася за окислення глюкози + глутаміну (3,03 ± 0,54 в.о.), глюкози + глутаміну + пірувату (2,82 ± 0,51 в.о.), глюкоза + ізоцитрат (2,71 ± 0,33 в.о.), глюкози + малату (2,75 ± 0,38 в.о.), глюкози + монометилсукцинату (2,64 ± 0,42 в.о.) або глюкози + диметил-α-кетоглутарату (2,36 ± 0,33 в.о.) у порівнянні з максимальною швидкістю роз’єднаного дихання за окислення лише глюкози (1,73–2,02 в.о.) або за відсутності екзогенних субстратів окислення (1,76 ± 0,33 в.о.). Оптимальна концентрація FCCP виявилася найвищою (1,75 мкМ) за окислення суміші глюкози + глутаміну + пірувату та найнижчою (0,5 мкМ) – за окислення екзогенного глутамату або суміші глюкози з такими субстратами, як ізоцитрат, малат, сукцинат або α-кетоглутарат. Прискорення дихання після додавання FCCP було найвищим за окислення диметил-α-кетоглутарату. Після досягання піка швидкості дихання ацинарними клітинами підшлункової залози у багатьох експериментах спостерігалось часозалежне сповільнення швидкості дихання. Це сповільнення дихання збільшувалося за збільшення концентрації FCCP і залежало від субстрату окислення. Найістотнішим воно було за окислення малату та ізоцитрату. Піруват сам по собі чи його комбінація з глутаміном та глюкозою значно знижували деполяризацію внутрішньої мембрани мітохондрій, спричинену дією FCCP, а також підвищували коефіцієнт еластичності залежності дихання від зміни мембранного потенціалу. Отже, суміш пірувату, глутаміну та глюкози є оптимальною для підтримання адаптивної здатності мітохондрій панкреатичних ацинусів відповідати на деполяризацію їхньої внутрішньої мембрани.
Кінетика гідролізу казеїну за допомогою нової пептидази Bacillus thuringiensis var. israelensis
О. В. Севастьянов1, Ю. А. Шестеренко1, О. А. Рижак1,
І. І. Романовська1, Н. А. Дзюблюк2, Л. Д. Варбанець2
1Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, Одеса;
2Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ;
e-mail: romairina@gmail.com
Отримано: 25 жовтня 2018; Затверджено: 14 березня 2019
Дослідження кінетики дії ензимів здійснюють, використовуючи рівняння Міхаеліса–Ментен і різні форми його лінеаризації, однак кожен з методів має свої переваги і недоліки, тому їх порівняння для визначення кінетики нових ензимів є актуальним. Метою цієї роботи було вивчення кінетичних особливостей гідролізу казеїну новою пептидазою Bacillus thuringiensis var. israelensis ІМВ В-7465 за допомогою різних методів лінеаризації рівняння Міхаеліса–Ментен із використанням декількох способів визначення активності ензиму. Встановлено задовільне узгодження значень кінетичних констант, одержаних методами Лайнуївера–Берка, Хейнса, Іді–Хофсті, Корніш–Боуден–Ейзенталя. Оптимальним для визначення Km і Vmax є метод Лайнуївера–Берка. Метод дослідження казеїнолітичної активності за допомогою о-фталевого діальдегіду (o-ФДА) порівняно з модифікованим методом Ансона і Кунітца дозволяє вірогідніше визначити Vmax реакції.
Вплив глутатіону на енергетичний обмін у мітохондріях печінки щурів за експериментальної нефропатії
Є. О. Ференчук, І. В. Геруш
ВДНЗ України «Буковинський державний медичний університет», Чернівці;
e-mail: yelena_f@ukr.net
Отримано: 17 жовтня 2018; Затверджено: 14 березня 2019
Окисне пошкодження мітохондрій та порушення енергетичного метаболізму призводить до розвитку багатьох патологій та захворювань. У роботі досліджено вплив глутатіону на активність ензимів мітохондріального дихального ланцюга та визначено вміст SH-груп у мітохондріях печінки щурів в умовах нефропатії, спричиненої фолієвою кислотою. Мітохондрії виділяли диференційним центрифугуванням. Визначали активність NADH-дегідрогенази, сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази та H+-ATPази. Показано, що за нефропатії, активність досліджуваних ензимів та вміст SH-груп знижувалась, що може свідчити про інтенсифікацію вільнорадикальних процесів. Введення глутатіону сприяло зростанню вмісту SH-груп і активності ензимів II та V комплексів дихального ланцюга мітохондрій, але не впливало на активність цитохромоксидази в мітохондріях печінки щурів із нефропатією. Одержані результати показали позитивний ефект глутатіону на активність сукцинатдегідрогенази та H+-ATPази.
Фенольні сполуки рослин: біогенез та функції
Л. М. Бабенко1, О. Є. Смірнов2, К. О. Романенко1,
О. К. Tрунова3, І. В. Косаківська1
1Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України, Київ;
2ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
3Інститут загальної та неорганічної хімії ім. В. І. Вернадського НАН України, Київ;
e-mail: lilia.babenko@gmail.com
Отримано: 05 листопада 2018; Затверджено: 14 березня 2019
Фенольні сполуки (ФС) в рослинах відіграють значну роль у контролі росту, а також виконують важливі функції, зокрема антиоксидантну, структурну, атрактантну, сигнальну та захисну. В огляді описано історію відкриття та ідентифікації рослинних ФС, їх місце в складній системі шляхів біосинтезу вторинних метаболітів. Розглянуто функції ФС на макромолекулярному, клітинному, організменному та популяційному рівнях. Висвітлено основні етапи дослідження рослинних фенолів, розгалуження та пластичності фенольного синтезу, шляхи утворення ФС у рослинній клітині та ензими синтезу ФС. Обговорюється участь ФС в процесах дихання і фотосинтезу, окисно-відновних процесах, а також в регуляції фізіологічного стану рослин.
Конференція молодих вчених «Актуальні аспекти біохімії та біотехнології – 2019»
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, 21-22 березня 2019, Київ
Параметри зсідання плазми крові щурів із гострою променевою хворобою за умов ентеросорбції
В. Чернишенко1, Є. Снежкова2, М. Мазур2, Т. Чернишенко1,
Т. Платонова1, О. Сидоренко2, Е. Луговськой1, В. Ніколаєв2
1Інститут біохімії ім О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ
Радіаційно-індукована коагулопатія (РІК) є однією з основних причин смерті під час гострої променевої хвороби (ГПХ). Метою цієї статті було охарактеризувати реакцію системи гемостазу на ГПХ помірного рівня на 1-шу і 9-ту добу після опромінення, виявити молекулярні маркери системи зсідання крові, які найбільше постраждали за ГПХ, та оцінити ефект ентеросорбції на розвиток індукованих опроміненням змін. Рівень агрегації тромбоцитів, активований частково тромбопластиновий час (АЧТЧ) і концентрацію фібриногену визначали стандартними методами. Рівень протеїну C (ПС) вимірювали за допомогою хромогенного субстрату S2366 (p-Glu-Pro-Arg-pNa) та ензиму-активатора з отрути Agkistrodon halys halys. Функціонально неактивні форми протромбіну (ФНФП) визначали, використовуючи паралельно два активатори – тромбопластин та активатор протромбіну з отрути Echis multisqumatis. Щури обох опромінених груп мали підвищений ризик внутрішньосудинного зсідання крові порівняно з обома контрольними групами. Виявлено статистично вірогідне скорочення часу зсідання крові в тесті АЧТЧ (24 ± 4 с порівняно з 33 ± 5 с) і підвищення концентрації фібриногену (4,2 ± 0,6 мг/мл порівняно з 3,2 ± 0,3 мг/мл). Обидва параметри нормалізувалися на 9-ту добу після радіаційного опромінення. Однак кількість тромбоцитів зменшувалася (0.3∙106 ± 0.05∙106 1/мкл порівняно з 0.145∙106 ± 0.04∙106 1/мкл) внаслідок порушення функції мегакаріоцитів. Рівень ПС знижувався після опромінення (70 ± 10%) і частково відновлювався на 9-ту добу (87 ± 10%). Введення щурам активованого вугілля (АВ) запобігало зниженню концентрації ПС після опромінення (86 ± 15%) і прискорювало її відновлення на 9-ту добу (103 ± 14%). Статистично вірогідне накопичення ФНФП було виявлено в плазмі крові опромінених щурів (група 1) на обох досліджуваних етапах. ФНФП не були виявлені у жодного з опромінених щурів, які отримували АВ (група 2). Характеристика системи гемостазу щурів, які піддавалися напівлетальній дозі опромінення, дозволила вибрати параметри, які можуть бути використані для моніторингу розвитку ГПХ. Крім основних коагуляційних тестів (АЧТЧ), вивчення агрегації тромбоцитів, рівня фібриногену та протеїна С, виявлення ФНФП може бути рекомендованим як дієвий інструмент для оцінки відповіді системи гемостазу на рентгенівське опромінення. Поява ФНФП свідчить про внутрішньосудинне утворення тромбіну і може вказувати на тромботичні ускладнення або дисеміноване внутрішньосудинне зсідання. Визначення ФНФП у плазмі крові опромінених щурів дозволило вивчити ефект ентеросорбції на розвиток змін, спричинених опроміненням. Показано, що ентеросорбція АВ перешкоджає накопиченню ФНФП. Антитромботичний ефект терапії АВ виявлено вперше. Також встановлено, що ГПХ спричинює активацію системи гемостазу, утворення тромбіну (виявлене за рахунок утворення ФНФП), незначне запалення (на що вказує зниження концентрації ПС) і тромбоцитопенію. Ентеросорбція АВ мінімізує запальні та прокоагулянті процеси, спричинені помірною дозою опромінення. Накопичення ФНФП можна вважати одним із найчутливіших маркерів відповіді системи зсідання крові на опромінення.
Взаємодія чотирьох алотропних модифікацій карбонових наночастинок із тканинами організму
С. Я. Парижак1, T. І. Думич1, С. M. Пешкова1,2,
Є. Є. Біла2, О. Д. Луцик1, A. Баррас3,
Р. Букерруб3, С. Сзунерітс3, Р. O. Білий1
1Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
2Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
3Лілльський університет, НЦНД, Центральний Лілль, ВІЕЦТ, Університет Валансьєна, Лілль, Франція;
e-mail: r.bilyy@gmail.com
Забруднення навколишнього середовища та технологічний прогрес призводять до утворення вуглецевих наночастинок, які становлять серйозний ризик для здоров’я. Вони присутні в сажі, пилу, тонері для друку і можуть виникати за шліфування та фрезерування матеріалів. Нейтрофіли людини здатні ізолювати чужорідний матеріал шляхом утворення нейтрофільних позаклітинних пасток (НПП), останні здатні стимулювати сильну запальну відповідь. У роботі було порівняно прозапальні властивості різних наноструктур на основі вуглецю: нанодіамантів, графен оксиду, фулеренів С60 і вуглецевих точок. Було протестовано ад’ювантні властивості вуглецевих наночастинок у моделі імунізації мишей за дослідження гуморальної (специфічні IgG і IgM антитіла) та клітинної (гіперчутливість сповільненого типу) імунної відповіді. Здатність НПП секвеструвати наночастинки вивчено на моделі повітряної кишені мишей, а активацію нейтрофілів перевірено шляхом відстеження флуоресцентно мічених нанодіамантів in vivo, та флуоресцентним аналізом із застосуванням нейтрофілів людини ex vivo. Усі вуглецеві наночастинки виявляли прозапальні ад’ювантні властивості, стимулюючи продукцію специфічних IgG, але не IgM антитіл (гуморальна імунна відповідь). Ад’ювантні властивості зменшувались у порядку від нанодіамантів, графен оксиду, фулеренів С60 до вуглецевих точок. Жодна із досліджуваних вуглецевих наноструктур не спричинювала появу реакції гіперчутливості сповільненого типу (клітинна імунна відповідь). Нанодіаманти і фулерени C60 були секвестровані в організмі НПП, що підтверджено на моделі повітряної кишені, і шляхом відстеження флуоресцентно мічених нанодіамантів in vivo.
Індукція апоптозу у лейкозних клітинах людини за дії нових похідних 2-аміно-5-бензилтіазолу
Н. С. Фінюк1,2, І. І. Івасечко1, O. Ю. Ключівська1, Ю. В. Остап’юк3,
В. П. Гренюх2, Я. Р. Шалай2, В. С. Матійчук3,
M. Д. Обушак3, A. M. Бабський2, Р. С. Стойка1
1Інститут біології клітини НАН України, Львів;
2Львівський національний університет імені Івана Франка, біологічний факультет, Україна;
3Львівський національний університет імені Івана Франка, хімічний факультет, Україна;
e-mail: stoika@cellbiol.lviv.ua
Похідні 2-аміно-5-бензилтіазолу є гетероциклічними сполуками, які виявляють різноманітні фармакологічні властивості, в тому числі протипухлинну дію, механізми якої ще недостатньо вивчені. Метою цього дослідження було з’ясування дії двох новосинтезованих похідних тіазолу ‒ 2,8-диметил-7-(3-трифторметил-бензил)піразоло[4,3-е]тіазоло-
[3,2-а]піримідин-4 (2Н)-он (сполука 1) і 7-бензил-8-метил-2-пропілпіразоло[4,3-е] тіазоло[3,2-а]-
піримідин-4(2Н)-он (сполука 2) ‒ на індукцію апоптозу та структуру ДНК у лейкозних клітинах людини. У цій роботі застосовували Вестерн-блот аналіз, ДНК-комет аналіз в лужних умовах, дифеніламіновий метод, ДНК-електрофорез в агарозному гелі, аналіз інтеркаляції ДНК із застосуванням метилового зеленого для вивчення впливу досліджуваних сполук на клітини лейкозу. Встановлено, що ці сполуки активують розщеплення PARP1 і каспази 3, а також збільшення рівня проапоптотичного протеїну Bim та специфічної мітохондріальної нуклеази EndoG, і зниження рівня антиапоптичного протеїну Bcl-2. Дія цих речовин призводить до одноланцюгових розривів у молекулі ДНК і фрагментації ДНК у лейкозних клітинах. Проте ці сполуки не зв’язуються з ДНК і не інтеркалюють у структуру її молекули. Отже, нові похідні 2-аміно-5-бензилтіазолу є потенційними сполуками, які індукують апоптоз у лейкозних клітинах людини.
Приготування висококонцентрованої аутологічної плазми крові, збагаченої тромбоцитами, для біомедичного використання
В. Чернишенко1, К. Штайнберг2, Н. Луговська1, М. Рижикова1,
Т. Платонова1, Д. Корольова1, Е. Луговськой1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2«Клініка доктора Запольскої», Київ, Україна
Клітинна терапія з використанням тромбоцитів є широко поширеним підходом в медицині для загоєння ран і регенерації тканин. Однак, найдоступніші методи дають змогу отримати не достатньо концентровані суспензії тромбоцитів (до 0,3∙106 1/мкл) або суспензії тромбоцитів, що частково або повністю втратили свою активність. У цьому дослідженні ми поставили за мету розробити простий та ефективний метод приготування суспензії нативних та інтактних тромбоцитів у концентрації понад 1∙106 1/мкл. Збагачену тромбоцитами плазму крові (ЗТПК) отримували зі свіжої крові здорових донорів (n = 5), при заборі крові як антикоагулянт використовували гепарин. Зразки ЗТПК осаджували і ресуспендували в аутологічній плазмі крові. Кількість та життєздатність тромбоцитів у кожному зразку визначали шляхом дослідження агрегації на агрегометрі Solar AP2110. Форма тромбоцитів і гранулярність цитоплазми, які вказують на нативність тромбоцитів, контролювали на потоковому цитометрі COULTER EPICS XL. Дослідження агрегації тромбоцитів у ЗТПК, отриманій з використанням різних кількостей гепарину, дозволило нам знизити кінцеві концентрації до кількості, яка ефективно запобігала зсіданню крові і не впливала на активність тромбоцитів (5 U/мл). ЗТПК, сконцентрована в 5 разів із загальною концентрацією клітин 1∙106 1/мкл, була здатна до активації аденозиндифосфатом (AДФ) (ступінь агрегації 54 ± 7%). Кількість клітин зі зміненою формою та гранулярністю в сконцентрованій суспензії не перевищувала 20%. Ці дані свідчать, про те, що тромбоцити зберігають здатність вивільняти ряд факторів росту та інші біологічно активні сполуки після стимуляції або ін’єкції в тканини за клітинної терапії. Зниження концентрації гепарину до того ж мінімізує крововилив в місці ін’єкції, що сприяє біомедичному застосуванню суспензії. Розроблено простий та ефективний метод приготування високо концентрованої ЗТП (1,2∙106 1/мкл) для біомедичного використання. Агрегатометрія і протокова цитометрія довели, що одержані тромбоцити інтактні й здатні активуватися. Препарат, що є аутологічним, може бути широко використаний для клітинної терапії без додаткових запобіжних заходів.
Прооксидантно-антиоксидантний баланс in vitro та in vivo за дії хіміотерапевтичних засобів на основі 4-тіазолідинону із протипухлинним потенціалом
Л. Кобилінська1, О. Ключівська2, Р. Лесик1, Р. Стойка2
1Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
2Інститут біології клітини НАН України;
e-mail: lesya8@gmail.com
Окислювальний стрес є одним із основних механізмів, за яким протипухлинні хіміотерапевтичні засоби пошкоджують нормальні тканини та органи. У той самий час, він є важливим біохімічним механізмом протипухлинної дії цих препаратів. Метою цього дослідження було визначити прооксидантно–антиоксидантний баланс in vitro та in vivo за дії нових гетероциклічних сполук із протипухлинним потенціалом на основі 4-тіазолідинону. Перевагою використання цих сполук in vivo є їхня низька загальна токсичність порівняно з доксорубіцином. Похідні 4-тіазолідинону (Les-3288, Les-3833, Les-3882) з раніше встановленою антинеопластичною активністю in vitro і протипухлинним ефектом in vivo синтезували, розчиняли у диметилсульфоксиді і вводили внутрішньоочеревинно щурам лінії Вістар щодня протягом 20 днів. Дози введених препаратів відповідали 10% LD50, а саме: доксорубіцин – 5,5 мг/кг, Les-3882 і Les-3833 – 10,7 мг/кг, а Les-3288 – 24,3 мг/кг. Вимірювали радикалпоглинальну активність щодо 1,1-дифеніл-2-пікрилгідразилу (DPPH) в досліджуваних препаратів. Активність ліпопероксидації оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів у тканинах печінки, серця і нирок щурів. Активність супероксиддисмутази, каталази і глутатіонпероксидази визначали в сироватці крові і тканинах щурів. Встановлено, що введення протягом 20 днів сполук Les-3288, Les-3833 і Les-3882 порушує прооксидантно–антиоксидантний баланс у піддослідних щурів. Виявлено зростання концентрації продуктів реакцій пероксидного окислення ліпідів і виснаження ензиматичної антиоксидантної системи в тканинах печінки, серця і нирок. Сполуки Les-3288, Les-3833 і Les-3882 виявляли меншу прооксидантну дію порівняно з ефектом доксорубіцину. За результатами впливу на прооксидантно–антиоксидантний баланс в обраних тканинах досліджувані сполуки можна розмістити таким чином: доксорубіцин >> Les-3833> Les-3288 >> Les-3882. Одержані результати узгоджуються з результатами наших нещодавніх експериментів щодо антинеопластичного ефекту цих похідних in vitro та їх протипухлинної дії in vivo. Також продемонстровано нижчу загальну токсичність їх in vivo порівняно з таким ефектом, показаним раніше для доксорубіцину.