Tag Archives: ензиматичний гідроліз АТР

Тіакалікс[4]арен С-1087 – селективний інгібітор кальцієвої помпи плазматичної мембрани клітин гладеньких м’язів

Т. О. Векліч1*, Р. В. Родік2, О. В. Цимбалюк3,
О. А. Шкрабак1, О. В. Малюк1, С. О. Карахім1,
С. Г. Вишневський2, В. І. Кальченко2, С. O. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
*e-mail: veklich@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
3Навчально-науковий інститут високих технологій,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, Україна

Отримано: 01 вересня 2023; Виправлено: 23 жовтня 2023;
Затверджено: 01 грудня 2023; Доступно онлайн: 18 грудня 2023

За допомогою методів ензимного та кінетичного аналізів показано, що 5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(фенілсульфоніліміно)метиламіно-25,27-дигексилокси-26,28-дигідрокситіакалікс[4]арен С-1087 ефективно інгібує Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичної мембрани клітин міометрія щурів (І0,5 = 9,4 ± 0,6 мкМ). При цьому ефектор не впливає на відносну активність інших мембранних АТРаз. За допомогою конфокальної мікроскопії та Са2+-чутливого флуоресцентного зонда fluo-4 було показано, що дія тіакалікс[4]арену С-1087 на іммобілізовані міоцити матки збільшує цитозольну концентрацію Са2+. Тензометричні дослідження гладеньких м’язів матки щурів із подальшим механокінетичним аналізом показали, що тіакалікс[4]арен С-1087 значно знижує максимальну швидкість розслаблення як спонтанної скоротливої відповіді, так і скорочення, спричиненого гіперкалієвим розчином.

Тіакалікс[4]арен С-1193 – афінний інгібітор натрієвої помпи, збільшує внутрішньоклітинну концентрацію іонів Са та модифікує скоротливу активність міометрія

Т. О. Векліч1*, С. О. Черенок2, О. В. Цимбалюк3,
О. А. Шкрабак1, С. О. Карахім1, А. І. Селіхова2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
*e-mail: veklich@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
3Навчально-науковий інститут високих технологій,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна

Отримано: 16 червня 2023; Виправлено: 31 вересня 2023;
Затверджено: 27 жовтня 2023; Доступно онлайн: 06 листопада 2023

З використанням методів ензиматичного та кінетичного аналізу було продемонстровано, що тіакалікс[4]арен-біс-гідроксиметилфосфонова кислота С-1193 має більш ефективну інгібіторну дію на Na+,K+-АТРазну активність у плазматичній мембрані клітин міометрія (І0,5 = 42,1 ± 0,6 нМ) порівняно з калікс[4]арен-біс-гідроксиметилфосфоновою кислотою С-99, і практично не впливає на питомі активності інших АТРаз, що локалізовані у цій субклітинній структурі. Методом конфокальної мікроскопії з використанням Са2+-чутливого флуоресцентного зонду fluo-4 показано, що тіакалікс[4]арен С-1193 зумовлює зростання внутрішньоклітинної концентрації Са2+ в іммобілізованих міоцитах матки. Тензометричними дослідженнями продемонстровано, що С-1193 (10 та 100 мкМ) модифікує механокінетику спонтанних ізометричних скорочень міометрія. На тлі використання С-1193 (10 мкМ) спостерігали збільшення ізометричних фазних скорочень, спричинених електромеханічним (деполяризація гіперкалієвим розчином) та фармакомеханічним спряженням (за умов дії утеротонічного гормону окситоцину, нейромедіатора ацетилхоліну та селективного агоніста мускаринових ацетилхолінових рецепторів М3-типу цевімеліну). Передба­чається, що отримані експериментальні дані, які були одержані з використанням тіакалікс[4]арену С-1193 – селективного та ефективного інгібітора Nа+,K+-АТРази, можуть мати значення для з’ясування мембранних механізмів катіонного обміну у гладеньких м’язах, зокрема, під час вивчення ролі плазматичної мембрани в забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в них, а також у регуляції іонного гомеостазу в міоцитах.

Калікс[4]арен С-956 селективно інгібує Са(2+),Mg(2+)-АТРазу плазматичної мембрани клітин міометрія

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Ю. В. Ніконішина1, Р. В. Родік2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: veklich@biochem.kiev.ua; manli@ioch.kiev.ua

Із використанням методів ензиматичного та кінетичного аналізу продемонстровано, що калікс[4]арен С-956 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил-(феніл-сульфоніліміно)метиламіно-25,27-діоктилокси-26,28-дипропоксикалікс[4]арен) у концентрації 100 мкМ чинив найбільшу інгібіторну дію на Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичної мембрани порівняно з іншими аналогами цього калікс[4]арену і не впливав на питому активність інших мембранних АТРаз. За допомогою конфокальної мікроскопії з використанням кальційчутливого флуоресцентного зонда fluo-4 показано, що внесення калікс[4]арену С-956 до іммобілізованих міоцитів матки зумовлює зростання рівня внутрішньоклітинної концентрації  Са2+. Аналіз впливу калікс[4]арену С-956 на ефективний гідродинамічний діаметр міоцитів міометрія продемонстрував, що додавання розчину цієї сполуки до суспензії міоцитів зменшує вказаний показник на 45,5 ± 9,4% подібно до дії утеротоніка окситоцину.

Каліксарен С-107 збільшує спорідненість Nа(+),K(+)-АТР-ази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин до уабаїну

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Р. В. Родік2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: vik@ioch.kiev.ua

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, обробленій 0,1%-им розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію каліксарену С-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арен) на Na+,K+-АТР-азну активність.
Доведено, що ця сполука здатна збільшувати спорідненість ензиму до уабаїну: уявна константа інгібування 0,5) Na+,K+-АТР-ази уабаїном зменшується з 26,9 ± 1,3 мкM дo 10,9 ± 0,6 мкM. Проте сам уабаїн не впливає на спорідненість Na+,K+-АТР-ази до зазначеного калікс[4]арену.

Інгібіторний вплив калікс[4]арену С-90 на ензиматичну активність транспортних Са(2+),Mg(2+)-АТРаз плазматичної мембрани та саркоплазматичного ретикулума міометрія

Т. О. Векліч

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: veklich@biochem.kiev.ua

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран та клітинах міометрія, оброблених 0,1%-им розчином дигітоніну, показано, що калікс[4]арен С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(феніл­сульфоніліміно)метиламіно-25,26,27,28-тетра­пропокси-калікс[4]арен) ефектив­ніше інгібує ензиматичну активність Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани, ніж відповідну активність у саркоплазматичному ретикулумі (величини коефіцієнта інгібування І0,5 становлять 20,2 ± 0,5 та 57,0 ± 1,4 мкМ для Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани та саркоплазматичного ретикулума відповідно (n = 5)). Дослідили кінетичні закономірності інгібувальної дії калікс[4]арену С-90 на Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичної мембрани та саркоплазматичного ретикулума. Цей інгібітор діє на обидві помпи за механізмом повного неконкурентного інгібування. Під впливом калікс[4]арену С-90 відбувається підвищення концентрації Са2+ в клітині та зменшується ефективний гідродинамічний діаметр гладеньком’язових клітин подібно до дії утеротоніка окситоцину.

Кінетичні закономірності дії калікс[4]арену С-90 на Са(2+),Mg(2+)-АТРазну активність плазматичної мембрани та на концентрацію Са(2+) в незбуджених клітинах міометрія

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Ю. Ю. Мазур1, Р. В. Родік2,
В. І. Бойко2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@ioch.kiev.ua

Са2+,Mg2+-АТРаза плазматичної мембрани є важливим елементом загального механізму контролю базального тонусу міометрія, яка також частково забезпечує релаксацію м’язової напруги після скорочення м’язу. В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, обробленій 0,1%-им розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію калікс[4]арену С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(фенілсульфоніліміно)-метиламіно-25,26,27,28-тетрапропокси-калікс[4]арен) на Са2+,Mg2+-АТРазну активність ензиму. Калікс[4]арен С-90 ефективно пригнічує Са2+,Mg2+-АТРазну активність ензиму (значення І0,5 для С-90 становить 20,2 ± 0,5 мкМ). Інгібувальна дія калікс[4]арену С-90 на роботу Са2+-помпи передусім пов’язана саме з кооперативним впливом чотирьох просторово орієнтованих на калікс[4]ареновій платформі фенілсульфоніліміно-трифторометилацетамідних груп, а не з дією суто тетрафенольного макроциклу чи з дією окремих фармакофорних сульфоніламідинових груп. Із урахуванням встановлених кінетичних закономірностей інгібувальної дії калікс[4]арену С-90 на Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичної мембрани розбудовано стаціонарну кінетичну модель контролю рівня базальної концентрації Са2+ в незбуджених міоцитах матки. Припускається, що одержані результати можуть бути перспективними для створення на основі калікс[4]арену С-90, фармакологічного препарату нового («супрамолекулярного») покоління – стимулятора базального тонусу матки.

Кінетика інгібіторної дії калікс[4]арену С-90 на активність транспортної Ca(2+),Mg(2+)-АТРази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Ю. Ю. Мазур1,
Р. В. Родік2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@ioch.kiev.ua

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, яку було оброблено 0,1%-им розчином дигітоніну, досліджували кінетичні закономірності інгібуючої дії калікс[4]арену С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(фенілсульфоніліміно)метиламіно-25,26,27,28-тетрапропокси-калікс[4]арен) на Са2+,Mg2+-АТРазну активність. Перевіряли спорідненість зазначеного ензиму до АТР, іонів Mg та Са в залежності від концентрації каліксарену С-90, а також його вплив на кооперативний ефект і на максимальну швидкість гідролізу АТР. Встановлено, що на спорідненість Са2+,Mg2+-АТРази до АТР каліксарен С-90 практично не впливає, що свідчить про відсутність конкуренції між центрами зв’язування АТР та С-90. Також відзначено відсутність впливу на спорідненість та кооперативний ефект іонів Са у разі застосування каліксарену С-90 в концентрації до 50 мкМ. Під впливом калікс[4]арену С-90 відмічено незначне зростання коефіцієнта активації Са2+,Mg2+-АТРази хлоридом магнію. У всіх трьох випадках спостерігається істотне зменшення максимальної швидкості гідролізу АТР, що в поєднанні з відсутнім впливом на константу спорідненості свідчить про неконкурентний механізм інгібування каліксареном С-90 Са2+,Mg2+-АТРазної активності.