Tag Archives: фібриноген

Валідація діагностичного алгоритму для моніторингу показників коагуляції у вагітних

Д. С. Корольова1, А. О. Павленко1, A. Алторай2, С. І. Жук3,
І. В. Ус3, Ю. О. Царик1, A. Шураньї2, В. О. Чернишенко1*

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Медична школа імені Альберта Сент-Дьєрдья, Сегедський університет, Сегед, Угорщина;
3Національна медична академія післядипломної освіти імені П. Л. Шупика, Київ, Україна;
*e-mail: bio.cherv@gmail.com

Отримано: 19 травня червня 2023; Виправлено: 05 червня 2023;
Затверджено: 07 червня 2023; Доступно онлайн: 11 липня 2023

Тромбози є одними з найнебезпечніших ускладнень вагітності. Тому важливе значення має підбір відповідних тестів і стандартизація методик точної діагностики стану системи зсідання крові. У цій роботі ми досліджували декілька молекулярних маркерів загрози внутрішньосудинного тромбоутворення та оцінювали функцію тромбоцитів у вагітних протягом терміну гестації. Ми провели незалежні вимірювання за тією ж методологією для різних когорт пацієнтів, вибраних у Києві (Україна) та в Сегеді (Угорщина). D-димер і розчинний фібрин вимірювали за допомогою медоту ELISA. Рівень протеїну С оцінювали за допомогою аналізу хромогенного субстрату. Концентрацію фібриногену вимірювали спектрофотометричним методом із використанням тромбіноподібного ферменту. Функціональну активність тромбоцитів оцінювали за допомогою агрегатометрії. Статистичний аналіз даних проводили за допомогою тесту Краскела-Уолісса. Статистично достовірне підвищення концентрації фібриногену від першого до третього триместру вагітності було показано для обох досліджуваних когорт пацієнток (у середньому 5-6 мг/мл на третьому триместрі). Застосовані методи дозволили виявити ті ж тенденції зниження рівня протеїну С, а також появу помірних кількостей D-димеру (до 300 нг/мл) і розчинного фібрину (до 10-15 мкг/мл). Функціональна активність тромбоцитів була підвищена в першому триместрі вагітності та незначно знижувалася протягом наступних триместрів. Результати показали зміни в системі зсідання крові вагітних під час гестації з однаковою ефективністю незалежно від обраних когорт, часу та місця вимірювань. Застосування на практиці запропонованого алгоритму діагностики може дозволити оцінити ризик тромботичних ускладнень під час вагітності.

Загальний гемостатичний потенціал плазми крові та його зв’язок із молекулярними маркерами системи гемостазу в пацієнтів зі стенозом коронарної артерії

Н. B. Сторожук1, Л. В. Пирогова2, Т. М. Чернишенко2,
О. П. Костюченко2, Т. М. Платонова2, О. Б. Сторожук1,
Б. Г. Сторожук1, Г. К. Березницький2, Є. М. Макогоненко2*

1Вінницький національний медичний університет ім. М. І. Пирогова, Україна;
2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
*e-mail: ymakogonenko@gmail.com

Отримано: 01 квітня 2021; Затверджнено: 22 вересня 2021

Вивчали зв’язок між показниками гемостатичного потенціалу та концентраціями молекулярних маркерів системи гемостазу: розчинного фібрину (sf), D-димеру (DD), фібриногену (Fg) та протеїну C (PC) в пацієнтів зі стенозом коронарної артерії через 6 місяців після стентування. У хворих було виявлено три напрями зміни стану системи гемостазу: збільшення фібринолітичної активності у ~18% пацієнтів; збільшення коагуляційної активності (В) у ~31% пацієнтів; підтримка балансу між згортанням і фібринолізом (А) в ~51% пацієнтів. У пацієнтів зі стенозом без ознак стенокардії продемонстровано сильну кореляцію за Пірсоном між часом напівлізису згустку та загальним гемостатичним потенціа­лом (ЗГП) (r = 0,75, P << 0,05), помірна залежність між концентраціями sf – D-димер (r = 0,67, P < 0,05), майже повний зв’язок між потенціалом згортання (ЗП) і ЗГП (r = 0,975, P << 0,05) та сильний зв’язок між ЗП і фібринолітичним потенціалом (ФП) (r = 0,80, P << 0,05). У пацієнтів із ознаками стабільної стенокардії виявлено майже повний зв’язок між концентрацією sf та D-димеру (r = 0,981, P << 0,05), ЗП і ЗГП (r = 0,979, P << 0,05) та сильний зв’язок між ЗП та ФП (r = 0,846, P << 0,05). Обговорюються можливі функціональні механізми зв’язку між цими параметрами.

Тромбоеластографічне дослідження фібринового згустка та молекулярні основи максимальної щільності згустка

Д. С. Корольова1*, Є. М. Стогній1, В. І. Грищук1, С. І. Жук2,
І. В. Ус2, Т. М. Чернишенко1, О. П. Костюченко1, К. П. Клименко1,
О. М. Платонов1,3, O. I. Іващенко3, В. О. Чернишенко1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Національний університет охорони здоров’я України імені П. Л. Шупика, Київ, Україна;
3ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
*e-mail: d.korolova@gmail.com

Отримано: 29 січня 2021; Затверджено: 23 квітень 2021

Максимальна щільність згустка (MCF) основний параметр тромбоеластографії (TEG), який відображає стабільність згустка. Проведено пошук маркерів, які можуть впливати на збільшення MCF та визначено молекулярні маркери та параметри зсідання крові, задіяні у таких механізмах. Зразки крові вагітних жінок із плацентарною дисфункцією було відібрано в Перинатальному центрі міста Києва. TEG проведено на цільний крові в EXTEM та INTEM тестах. АЧТЧ, МНВ, концентрацію фібриногену та агрегацію тромбоцитів вимірювали за допомогою традиційних підходів лабораторної діагностики. D-димер визначали в сандвіч-імуноензимному аналізі з використанням моноклональних антитіл III-3B та II-4D. Відносну активність прошивки фактором XIIIa вимірювали шляхом прямого кількісного визначення прошитого γ-ланцюга фібрину методом Вестерн-блот із використанням моноклональних антитіл II-4D. Концентрації D-димеру та фібриногену, час зсідання за тестом АЧТЧ, МНВ та ступінь агрегації тромбоцитів не корелювали з MCF. Однак, ми виявили позитивну кореляцію MCF із активністю фактора XIIIa: 0,51 та 0,87 для EXTEM та INTEM відповідно. Одержані дані свідчать про те, що за нормальної чи дещо підвищеної концентрації фібриногену щільність фібринового згустка буде в основному залежати від активності фактора XIIIa. Таким чином, безпосереднє визначення активності фактора XIIIa в плазмі крові пацієнтів може бути важливим для прогнозування ризику внутрішньосудинного  зсідання. Оцінка вмісту та активності окремих факторів зсідання крові або інших компонентів системи зсідання може бути корисним доповненням до MCF діагностики, чим не слід нехтувати.

Люди від молекул

В пам’ять професора Рассела Дуліттла, професора Едуарда Луговського
та їхньої дружби, що пережила обох

В. О. Чернишенко

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com

Отримано: 02 липня 2020; Затверджено: 21 липня 2020

Пригадуючи Едуарда Луговського та Рассела Дуліттла ми наводимо декілька епізодів їхнього життя та праці. Рассел Дуліттл, американський біохімік, та його друг і колега український вчений Едуард Луговськой, вивчали структуру та функції фібриногену і, нарешті, об’єднали свої зусилля у виявленні нового механізму міжмолекулярної взаємодії молекул фібрину через суперспіральні регіони. Результати їхньої спільної роботи та обговорень було викладено в статті «Bβ125-135 ділянка молекули фібрину бере участь у латеральній асоціації протофібрил». Суттєва частина статті присвячена поезії Едуарда Луговського, яка надихала обох учених на працю та життя. Тут ми наводимо спогади про їхню співпрацю, їхні листи, надіслані один одному, фрагменти рукописів та спільну фотографію Рассела Дулітла та Едуарда Луговського.

Нове моноклональне антитіло до αC-регіона фібрин(оген)у для визначення ранніх форм розчинного фібрину

Н. Е. Луговська1, І. М. Колеснікова1, Є. М. Стогній1, В. О. Чернишенко1*,
А. В. Ребрієв1, О. П. Костюченко1, Г. К. Гоголінська1, Н. А. Дзюблюк2,
Л. Д. Варбанець2, Т. М. Платонова1, С. В. Комісаренко1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ.
*e-mail: bio.cherv@gmail.com

Отримано: 08 травня 2020; Затверджено: 30 червня 2020

Одержання нових моноклональних антитіл (mAbs) до фібрин(оген)у та його фрагментів є важливим для вивчення механізмів утворення тромбу, пошуку нових антитромботичних агентів та створення імунодіагностикумів. Метою даної роботи було одержати та охарактеризувати нове mAb до αС-регіона молекули фібрин(oген)у людини. Наявність mAb до цієї гнучкої частини молекули фібрин(oген)у дозволить вивчити роль її αС-регіона в процесі полімеризації фібрину, а також розробити імунодіагностичний підхід для виявлення найбільш ранніх форм розчинного фібрину за допомогою бісайтового імуноензимного аналізу. Використовуючи гібридомну технологію, ми одержали mAb 1-5A до αC-регіону молекули фібрин(оген)у. Його було охарактеризовано із використанням декількох варіантів імуноензимного аналізу та вестернблот-аналізу. Застосування специфічних протеїназ разом із MALDI-TOF аналізом дозволило нам локалізувати його епітоп у фрагменті 537-595 Aα-ланцюга молекули фібрин(oген)у. МАb 1-5А може бути використано як детектуюче tag-антитіло в бісайтовому імуноензимному аналізі для кількісного визначення ранніх форм розчинного фібрину, які ще не піддалися розщепленню плазміном і зберігають С-кінцеві ділянки своїх αC-регіонів. Наявність таких ранніх форм розчинного фібрину в кровотоці є прямим свідченням активації системи зсідання крові, генерування тромбіну та небезпеки утворення внутрішньосудинних тромбів. Їх визначення дасть додаткову більш точну інформацію про стан системи зсідання крові та ризик тромбоутворення, що дуже важливо для своєчасного та правильного підбору адекватної антитромботичної терапії. MAb 1-5A ефективно зв’язує αC-вмісні молекули фібриногену й фібрину в плазмі крові та може бути використане для вивчення протеїно-протеїнових та протеїно-клітинних взаємодій αC-регіонів фібрин(оген)у.

Структура і функції BβN-доменів фібриногену

Л. Медвідь*, С. Яковлев

Center for Vascular and Inflammatory Diseases and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA;
*e-mail: Lmedved@som.umaryland.edu

Отримано: 17 травня 2020; Затверджено: 30 червня 2020

Фібриноген – поліфункціональний протеїн плазми крові, що бере участь в різних фізіологічних і патологічних процесах шляхом взаємодії своїх численних доменів із різними лігандами і клітинними рецепторами. Серед доменів фібриногену, два BβN-домени утворені N-кінцевими ділянками двох Bβ-ланцюгів, що включають амінокислотні залишки Bβ1-64. Хоча сталого уявлення про їхню конформацію немає, а експерименти з рекомбінантним димерним  (Bβ1-66)2 фрагментом, який відповідає парі цих доменів, не виявили у ньому впорядкованої структури, деякі дані дозволяють припустити, що ці домени у нативній молекулі можуть бути простoрово впорядковані. Проте,  їхні основні функціональні властивості вивчено досить добре. Відщеплення фібринопептидів B (амінокислотні послідовності Bβ1-14) від цих доменів у разі перетворення фібриногену у фібрин призводить до експозиції  численних  сайтів зв’язування у βN-доменах фібрину (послідовність β15-64). Ці сайти забезпечують взаємодію βN-доменів із різними протеїнами і клітинами, що обумовлює їхню участь у різних процесах, зокрема у самоскладанні фібрину, фібрин-залежному ангіогенезі, а також у фібрин-залежній трансміграції лейкоцитів у процесі запалення. Метою цього огляду є узагальнення сучасного уявлення про структуру та функції цих доменів фібриногену і фібрину та їхньої функціональної ролі.

Агрегація тромбоцитів, проліферація ендотеліоцитів і міграція ракових клітин опосередковані Bβ1(15)-42 фрагментом фібриногену

Є. М. Стогній1, М. В. Рижикова1, А. В. Ребрієв1, М. Д. Кучма2,
Р. Ю. Марунич1, В. О. Чернишенко1*, В. А. Шаблій2, Н. М. Липова3,
О. Ю. Сломінський1, Л. В. Гарманчук4, Т. М. Платонова1, С. В. Комісаренко1

1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, Україна;
2Інститут клітинної терапії, Київ, Україна;
3Університет Луїсвілла, США;
4ННЦ “Інститут біології та медицини”, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
*e-mail: bio.cherv@gmail.com

Отримано:  23 грудня 2019; Затверджено: 27 березня 2020

Молекула фібриногену містить численні ділянки зв’язування для різних типів клітинних рецепторів і виконує роль сполучної ланки між системою зсідання крові та клітинною адгезією. У цій статті описано отримання форми фібриногену, позбавлену фрагменту Bβ1-42 за допомогою спрямованого протеолізу, для вивчення ролі цієї послідовності у адгезивних властивостях тромбоцитів, ендотеліоцитів і ракових клітин. Фібриноген та фібрин, позбавлені Bβ1-42 та Bβ15-42 фрагментів відповідно (desβ1-42 фібриноген і desABβ15-42 фібрин), отримано за допомогою протеїнази з отрути Echis multisquamatis. Відщеплений фрагмент отримували за допомогою HPLC та ідентифікували з використанням MALDI-TOF. ADP- і колаген-індуковану агрегацію тромбоцитів за пристуності фібриногену desBβ1-42 вивчали за допомогою агрегометра. Проліферацію клітин аорти миші (MAEC) і клітин пуповинної вени людини (HUVEC) вивчали з використанням фібрину desABβ15-42 як матриці. Виживаність клітин MAEC оцінювали з використанням MTT-тесту. Для оцінки проліферативної активності HUVEC розраховували час подвоєння. Міграцію клітин раку легенів Н1299 вивчали за допомогою in vitro тесту подряпини. Пряме порівняння поведінки клітин за присутності нативної та частково гідролізованої форм показало порушення процесів клітинної адгезії за пристуності фібриногену desBβ1-42 та фібрину desBβ15-42. Ступінь агрегації тромбоцитів незначно знижувався за присутності фібриногену desBβ1-42, однак було виявлено дезагрегацію тромбоцитів на рівні 15-20%. Ми також виявили значне зниження інтенсивності поділу клітин HUVEC та інгібування виживаності клітин лінії MAEC вирощених на матриці з desABβ15-42 фібрину. Крім того, фібриноген desBβ1-42 модулював рухливість клітин лінії H1299 in vitro і знижував інтенсивність “заростання подряпини” до 20% порівняно з повнорозмірним фібриногеном. Показано, що фрагмент 1-42 BβN-домену молекули фібриногену не є необхідним для агрегації тромбоцитів, однак вносить вклад у формування фібриново-тромбоцитарного тромбу на пізніших стадіях. У той же час, цей фрагмент може бути важливим­ для забезпечення міцних міжклітинних контактів та виживаності ендотеліоцитів. Також  амінокислотна послідовність 1-42 BβN-домену підтримує міграцію ракових клітин, що дозволяє розглядати взаємодії з фібриногеном як потенційну мішень протиракової терапії. Фрагмент Bβ1-42 молекули фібриногену вносить вклад у ефективність міжклітинних взаємодій різних типів клітин, включаючи тромбоцити, ендотеліоцити і ракові клітини.

Порівняльний аналіз впливу аніонів хлору і фтору на полімеризацію фібрину

Л. В. Пирогова1, Г. К. Березницький1, Г. К. Гоголінська1, Т. М. Платонова1,
І. М. Колеснікова1, О. О. Масенко1, Р. Ю. Маруніч1, П. Ю. Цап1,
Ю. В. Ушенін2, Є. М. Макогоненко1, Е. В. Луговськой1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут фізики напівпровідників ім. В. Є. Лашкарьова НАН України, Київ;
e-mail: ymakogonenko@gmail.com

Отримано: 25 квітня 2019; Затверджено: 18 жовтня 2019

Досліджено вплив солей NaCl i NaF в межах 0,1–0,225 М концентрацій  на окремі стадії полімеризації фібрину, а саме: швидкість активації фібриногену тромбіном, швидкість формування протофібрил, швидкість лате­ральної асоціації протофібрил і величину максимального поглинання згустку при 350 нм. Встановлено, що аніони хлору однаково гальмують швидкість утворення фібрину із фібриногену і формування протофібрил за дії тромбіну. Показано, що аніони­ хлору значно ефективніше аніонів  фтору інгібують швидкість латеральної асоціації і максимальне поглинання згустків із фібрину desA та desAB. Було визначено компоненту інгібувальної дії аніонів хлору, не пов’язаної з іонною силою розчину, і показано її вплив на окремі стадії полімеризації. Знайдено, що аніони хлору зв’язуються з фібриновим згустком. Із використанням методу поверхневого плазмонного резонансу і фібринспецифічного монАТ FnI-3c встановлено, що швидкість експозиції неоантигенної детермінанти монАТ в шарнірних регіонах молекули фібриногену в процесі її трансформації у фібрин за дії тромбіну гальмується аніонами хлору в кореляції з гальмуванням швидкості латеральної асоціації протофібрил. Висловлено припущення, що інгібувальна дія аніонів хлору складається з іонної компоненти і з компоненти, що блокує конформаційну рухливість молекули шляхом зв’язування з її шарнірними ділянками і сайтами полімеризації.

Загальний гемостатичний потенціал плазми крові і його зв’язок із деякими молекулярними маркерами системи гемостазу у хворих на хронічні захворювання нирок VD стадії

Б. Г. Сторожук1, Л. В. Пирогова2, Т. М. Чернишенко2,
О. П. Костюченко2, І. М. Колеснікова2, Т. М. Платонова2,
О. Б. Сторожук1, Л. О. Сторожук1, Г. К. Березницький2, П. Ю. Цап2,
О. О. Масенко2, Є. М. Макогоненко2, Е. В. Луговськой2

1Вінницький національний медичний університет ім. М. І. Пирогова, Україна;
2Інститут біохімії ім О.В.Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: makogonenko@biochem.kiev.ua

Визначали величини загального, фібринолітичного потенціалу та потенціалу зсідання плазми крові за методом глобального потенціалу М. Blomback, а також величини концентрацій молекулярних маркерів системи гемостазу: розчинного фібрину (sf), D-димеру, фібриногену (Fg) і протеїну С (88 хворих, із них 52 – чоловіки, 36 – жінки). Показано, що активність системи гемостазу в жінок вірогідно вище, ніж у чоловіків. Розподіл хворих за трьома групами залежно від концентрації sf: менше норми – sf ≤ 3, близько норми – 3 < sf < 4 та більше норми – sf > 4 мкг/мл дозволив встановити підвищення значень параметрів гемостатичного потенціалу і концентрацій молекулярних маркерів залежно від концентрації sf у групах хворих. Парний кореляційний аналіз зв’язку між параметрами гемостатичного потенціалу та концентраціями молекулярних маркерів виявив збільшення сили зв’язку до сильного та дуже сильного між параметрами систем зсідання, фібринолізу і протеїну С за підвищення концентрації розчинного фібрину в плазмі крові хворих.

Ca(2+)-залежна регуляція активації фібринолітичної системи на D-доменах фібрин(оген)у

Т. А. Яценко, В. М. Рибачук, С. М. Харченко, Т. В. Гриненко

Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: tetyanaa.yatsenko@gmail.com

У роботі досліджено роль іонів кальцію D-доменів фібрин(оген)у в активації фібринолітичного процесу. Для встановлення значення Ca2+-залежних змін у D-доменах використано два типи D-фрагментів фібриногену та DD-фрагментів фібрину, оброблених кальційхелатуючими агентами та одержаних у присутності іонів кальцію. Дослідження активації плазміногену тканинним активатором на D- і DD-фрагментах показало інтенсифікацію утворення плазміну після обробки фрагментів EDTA. Швидкість активації проензиму на DD-фрагментах також дозозалежно збільшувалась у присутності EGTA. Стимулюючий ефект DD-фрагмента, попередньо обробленого хелаторами, на активацію  плазміногену дозозалежно знижувався в присутності Ca2+. Зміна інтенсивності стимуляції D-доменвмісними фрагментами фібрин(оген)у залежно від вмісту Ca2+ свідчить про необхідність кальційзалежних змін у D-доменах для експонування центрів взаємодії із плазміногеном і тканинним активатором та ініціації процесу фібринолізу.