Tag Archives: флуоресцентні протеїни
Вплив Т-домену дифтерійного токсину на pН ендосом
А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: lab.andrey@gmail.com
Ключовим етапом у реалізації цитотоксичної дії дифтерійного токсину (ДТ) є перенесення його каталітичного домену (Сd) з ендосом у цитозоль. Головну роль у цьому процесі відіграє транспортний домен (Тd), проте молекулярний механізм його функціонування залишається невідомим. Раніше нами було показано, що Тd здатний впливати на ендосомальний транспорт ДТ. Метою цієї роботи було вивчення впливу Тd дифтерійного токсину на компартменталізацію ендосом і на рН ендосомального середовища. Для цього ми використовували рекомбінантні фрагменти ДТ, які відрізнялися лише наявністю Тd в їхньому складі, що були злиті із флуоресцентними протеїнами. Показано, що фрагмент токсину із Td повільніше проходив шлях ранні–пізні ендосоми–лізосоми, та мав дещо відмінну від фрагмента ДТ (без Td) колокалізацію з ендосомальними маркерами. При цьому з 10- до 50-ї хв спостереження рН ендосом, що містять фрагменти ДТ із Тd, мали стале значення рН (~ 6,5). За цей час для ендосом, що містять фрагменти ДТ без Тd, продемонстровано зниження рН від 6,3 до 5,5. Одержані результати вказують на те, що Td інгібує закислення ендосомального середовища. Однією з можливих причин цього може бути вплив утвореного Т-доменом іонного каналу на процес зниження рН ендосом. Ця властивість Td може не тільки сповільнювати дозрівання ендосом, але і пригнічувати активацію рН-залежних ендосомальних протеїназ, що сприяє успішному транспортуванню Cd у цитозоль клітини.
Роль Т-домену дифтерійного токсину у внутрішньоклітинному транспортуванні токсинвмісних везикул
А. Ю. Лабинцев, Д. В. Колибо, Є. С. Юрченко,
А. А. Кабернюк, Н. В. Короткевич, С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Кїв;
е-mail: lab.andrey@gmail.com
Субодиниця В дифтерійного токсину (ДТ), яка складається із двох доменів, R – рецепторного та Т – трансмембранного, відіграє важливу роль у зв’язуванні токсину з рецептором на клітинах-мішенях та у транспортуванні каталітичної субодиниці А до цитозолю. Рекомбінантні аналоги субодиниці В є перспективними представниками унікального класу транспортувальних протеїнів, які здатні забезпечити доставку біологічно активних молекул до цитозолю клітин. Створення таких конструкцій вимагає з’ясування ролі кожного із фрагментів ДТ у транспортуванні комплексу рецептор–токсин.
У роботі досліджували роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні рекомбінантних фрагментів ДТ. Для цього порівнювали особливості внутрішньоклітинного транспортування R-домену та субодиниці В, яка містить в собі як R-, так і Т-домен. Рекомбінантні фрагменти ДТ мітили флуоресцентними протеїнами, що дозволило використовувати в дослідженні техніку колокалізації. Методом конфокальної мікроскопії встановлено відмінності у транспортуванні рекомбінантних похідних ДТ у клітинах лінії Vero. Показано, що R-домен швидше потрапляє до тубулярних компартментів клітини, ніж субодиниця В. Аналіз колокалізації R-домену та субодиниці В підтверджує майже лінійне її зростання за коефіцієнтом Пірсона (PCC) у разі збільшення часу інкубації. Проте відсоток субодиниці В, колокалізованої з R-доменом, визначений за коефіцієнтом Мандерса (M1), зростає нелінійно, що може свідчити про здатність субодиниці В потрапляти до певних компартментів клітини, недоступних для R-домену. Роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні та компартменталізації токсину, вірогідно, пов’язана з його здатністю до формування протонних каналів та взаємодії з комплексом протеїнів цитоплазми COPI.
Сучасні флуоресцентні методи дослідження механізмів активації лімфоцитів
Г. А. Любченко1, Р. М. Морєв2, Л. С. Холодна1
1Київський нацiональний унiверситет iмені Тараса Шевченка, Україна;
2Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ;
е-mail: gannalb@yahoo.com
Флуоресцентні протеїни є найперспективнішими інструментами для вивчення сигнальних процесів у лімфоцитах. Цей короткий огляд підсумовує нові досягнення в отриманнi зображень на основі методів флуоресценції, що розвивалися останніми роками, також обговорюються нові технологічні та методологічні досягнення, такі як люмінесцентнi фотоперемикачі, відновлення флуоресценції після фотознебарвлення (FRAP), перенесення енергії за допомогою флуоресцентного резонансу (FRET), флуоресцентна мікроскопія зображення тривалості життя (FLIM), фотоактивована локалізаційна мікроскопія (PALM), стохастична оптична мікроскопія реконструкції (STORM), стимульоване виснаження, індуковане випромінюванням (STED), повне внутрішнє відбиття флуоресценції (TIRF) та інші методики. Цей огляд також висвітлює останні досягнення в області аналізу зображень живих тканин in vitro, нові застосування проточної цитофлуориметрії iз використанням генетично кодованих флуоресцентних протеїнів і перспективи для розвитку нових імунологічних тест-систем на основі технології флуоресцентних протеїнів, сучасні прикладні підходи до використання проточної цитометрії з генетично кодованими флуоресцентними протеїнами, а також перспективи розвитку нових імунологічних тест-систем на основі технології флуоресцентних протеїнів.