Tag Archives: кінетичні властивості
Очистка і властивості каталітично активного фрагмента розчинної нуклеозидтрифосфатази з нирок бика
О. Ф. Макарчіков
Гродненський державний аграрний університет, Білорусь;
e-mail: a_makarchikov@yahoo.com
Із нирок бика одержано каталітично активний фрагмент розчинної нуклеозидтрифосфатази (NTPази). Очистка складалася з екстракції та 4 стадій колоночної хроматографії. Питома активність NTPази дорівнювала 37,7 Е/мг протеїну, ступінь очистки ~236 разів. Каталітичний фрагмент NTPази (рН-оптимум – 7,0) виявляє абсолютну залежність від катіонів двовалентних металів і специфічність відносно ITP, GTP, UTP та XTP; нуклеозиддифосфати, АТР, СТР і ІМР не є субстратами. Значення уявних Кm для Mg–ITP-, Mg–GTP- та Mg–ITP-комплексів розраховані графічним методом у координатах Хейнса і дорівнюють 1,70; 0,93 та 0,48 мМ відповідно. За даними гель-фільтрації та електрофорезу в ПААГ у присутності DSNa каталітично активний фрагмент NTPази складається з двох однакових поліпептидних ланцюгів з Мм 54,7 кДа. Одержані результати свідчать про те, що розчинна NTPаза з нирок бика складається з каталітичних і регуляторних структурних одиниць.
Ідентифікація ензимів гідролізу тіамінмонофосфату в печінці курей
І. К. Колос, О. Ф. Макарчиков
Гродненський державний аграрний університет;
Інститут біохімії біологічно активних сполук НАН Білорусі, Гродно;
e-mail: a_makarchikov@yahoo.com
У тварин тіамінмонофосфат (TMP) є інтермедіатом на шляху деградації коензимної форми вітаміну В1 – тіаміндифосфату. Натепер ензими, що беруть участь у метаболізмі TMP в тканинах тварин, не ідентифіковані. Мета роботи полягала в дослідженні гідролізу TMP в печінці курей. В гомогенаті печінки виявлені два ензими з активністю TMPази – розчинний, що виявляє рН-оптимум в кислому середовищі (рН 6,0), і мембранозв’язаний, активність якого максимальна при рН 9,0. Мембранозв’язана фосфатаза активується в 1,7 раза в присутності 5 мМ Mg2+. Уявна Km цього ензиму для TMP, розрахована в координатах Хейнса, становить 0,6 мМ. Левамізол інгібує мембранну TMPазу за безконкурентним шляхом з Ki = 53 мкМ. Активність розчинного ензиму не залежить від іонів Mg2+ і не інгібується левамізолом, уявна Km для TMP дорівнює 0,7 мМ. За даними гель-фільтрації на колонці з тойоперлом HW-55 молекулярна маса розчинної TMPази становить 17,8 кДа, при цьому пік активності TMPази збігається з піками флавінмононуклеотид- і п-нітрофенілфосфатазної активності. Одержані результати вказують на те, що TMP є фізіологічним субстратом низькомолекулярної кислої фосфатази, відомої також як низькомолекулярна протеїн-фосфотирозин-фосфатаза. Гідроліз TMP, який спостерігається в гомогенаті печінки курей за лужних рН, обумовлено дією лужної фосфатази.
Властивості мембраноасоційованої тіамінтрифосфатази печінки курей
І. К. Колос, О. Ф. Макарчиков
Гродненський державний аграрний університет,
Інститут біохімії біологічно активних сполук НАН Білорусі,
e-mail: a_makarchikov@yahoo.com
Ензими, які беруть участь у метаболізмі тіамінтрифосфату (ТТР) у тканинах птахів, дотепер не охарактеризовано. Метою цієї роботи було дослідити властивості тіамінтрифосфатази (ТТРази) печінки курей (Gallus gallus). Встановлено, що залежність швидкості гідролізу ТТР у гомогенаті печінки від рН має вигляд колоколоподібної кривої з максимумом рН 5,5–6,0. Катіони двовалентних металів (Mg2+, Ca2+) збільшують активність ТТРази в 17–20 разів, у присутності 5 мМ Mg2+ уявлена KM ензиму для ТТР, розрахована методом нелінійної регресії та в координатах Гейнса, становить 1,7–2,2 мМ. Моновалентні аніони (I–, SCN–, NO3–, Br–, Cl–) у концентрації 150 мМ виявляють інгібуючу дію, знижуючи швидкість ТТРазной реакції на 20–60%. Після центрифугування гомогенату печінки більше 85% ТТРазної активності виявлялося в осаді, що свідчить про мембранну локалізацію ензиму. Обробка осаду 1%-им дезоксихолатом натрію спричинює солюбілізацію мембран і виявлення в розчині 53% активності ТТРази. У разі хроматографії на колонці з тойоперлом HW-55 ТТРаза елюювалася разом з аденозин- та інозинтрифосфатазою в об’ємі, що відповідає протеїнам із Мм 700 кДа. Одержані дані свідчать про те, що гідроліз ТТР у печінці курей відбувається мембраноасоційованим протеїновим комплексом, який виявляє широку субстратну специфічність.