Tag Archives: кометний електрофорез
Реорганізація петельних доменів ДНК у бласт-трансформованих лімфоцитах людини і лімфоїдних лейкемічних Т-клітинах лінії Jurkat
К. Афанасьєва1, В. Олефіренко1, А. Мартиняк1, Л. Лукаш2, А. Сиволоб1*
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
2Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ;
*e-mail: sivolob@univ.kiev.ua
Отримано: 06 квітня 2020; Затверджено: 25 червня 2020
Петельні домени хроматину – важливі елементи як структури хроматину на вищих рівнях його організації, так і системи регуляції транскрипції. У наших попередніх роботах показано, що деякі важливі риси петельної організації можуть бути досліджені за допомогою кінетичного підходу в електрофорезі ізольованих клітин (кометному електрофорезі). Цю техніку застосовано для оцінки петельної організації ДНК лімфоїдних клітин: лімфоцитів людини; лімфобластів, культивованих протягом 24 і 44 год; злоякісних Т-клітин лінії Jurkat. Встановлено два параметри, що варіюють залежно від функціонального стану клітин. По-перше, частка ДНК у петлях великого розміру більше ~200 тис. пар основ істотно збільшувалась у (дедиференційованих) клітинах, за проліферації порівняно з термінально диференційованими лімфоцитами. По-друге, лінійна щільність петель, розміри яких не перевищують 200 тис. пар основ, знижувалась у транскрипційно активних клітинах та підвищувалась за їх інактивації.
Після лізису клітин петельні домени ДНК зберігають організацію хроматинових петель інтактних ядер
К. С. Афанасьєва, В. В. Олефіренко, А. В. Сиволоб
ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
e-mail: aphon@ukr.net
Кометний електрофорез виправдав себе не лише як метод детекції пошкоджень ДНК на рівні окремих клітин, але і як метод для дослідження просторової організації петельних доменів ДНК у нуклеоїдах. Зазвичай такі нуклеоїди одержують шляхом лізису клітин у високосольовому буфері (2,5 M NaCl) із детергентом: ці умови забезпечують видалення клітинних мембран та більшості хроматинових протеїнів, зберігаючи інтактними надспіралізовані петельні домени ДНК. У цій роботі ми здійснили кометний електрофорез нуклеоїдів, одержаних за низької концентрації солі (1 M NaCl). Такі нуклеоїди зберігають більшу частину гістонів і відповідно містять петлі значно більшою мірою схожі на нативні петлі хроматину. Показано, що, не дивлячись на кількісні відмінності, найбільш загальні властивості кінетики виходу ДНК із нуклеоїдів двох типів є подібними. Таким чином, петельні домени ДНК у нуклеоїдах, одержаних шляхом лізису клітин за високої іонної сили, можуть бути вдалою моделлю для дослідження просторової організації ДНК у хроматині.
Перерозподіл петельних доменів ДНК у лімфоцитах людини у разі бласттрансформації за впливу інтерлейкіну 2
К. С. Афанасьєва, М. І. Чопей, О. В. Лозовик, С. Р. Рушковський, А. В. Сиволоб
ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний
університет імені Тараса Шевченка, Україна;
e-mail: aphon@ukr.net
На вищих рівнях організації в інтерфазному ядрі хроматинові фібрили формують петельні домени. В основі петель часто знаходяться регуляторні ділянки генів – промотори і енхансери. Внаслідок цього петельні домени відіграють важливу роль у регуляції транскрипційної активності клітини. Досліджено кінетику виходу петель ДНК за кометного електрофорезу нуклеоїдів, одержаних із клітин двох типів, які відрізняються за своєю синтетичною активністю – лімфоцитів та лімфобластів людини. Активація лімфоцитів із перетворенням їх у лімфобласти (бласттрансформація) досягалася за допомогою інтерлейкіну 2. Одержані результати свідчать про перерозподіл петель у нуклеоїдах за активації (трансформації) лімфоцита. Після бласттрансформації на поверхні нуклеоїда спостерігалося збільшення кількості петель, що знаходяться на поверхні нуклеоїда, на фоні зниження частки внутрішніх петель. Таким чином, кометний електрофорез може бути використаний для реєстрації масштабних змін у клітинному ядрі, що супроводжують зміни функціонального статусу клітин.
Інтеркаляція протеїнів у ДНК як один з основних способів фіксації найстабільніших петельних доменів хроматину
М. І. Чопей, К. С. Афанасьєва, А. В. Сиволоб
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
e-mail: aphon@ukr.net; sivolob@univ.kiev.ua
Основний механізм формування треку ДНК за кометного електрофорезу нуклеоїдів, одержаних після лізису клітин із видаленням мембран та більшості протеїнів, полягає у витягуванні до анода негативно надспіралізованих петельних доменів ДНК, закріплених на протеїнах, що залишилися в нуклеоїді після лізису. Як склад цих залишкових протеїнових структур, так і природа їх особливо міцного зв’язку з основами петельних доменів до цього часу залишаються нез’ясованими. У цій роботі ми досліджували вплив хлорокіну, що інтеркалює в подвійну спіраль ДНК, а також агентів, що зумовлюють денатурацію протеїнів, на ефективність формування треку ДНК за кометного електрофорезу нуклеоїдів. Одержані результати свідчать, що навіть незначна денатурація протеїнів спричинює істотне зниження ефективності міграції петель за рахунок збільшення їхнього розміру. Аналогічний ефект має місце під час індукції локального розкручування ДНК у сайтах інтеркаляції хлорокіну. Обговорюється можливість топологічного характеру зв’язку основ петель ДНК із протеїнами нуклеоїда, за якого вони інтеркалюють у подвійну спіраль.