Tag Archives: субстратна специфічність
Очиcтка та фізико-хімічні властивості протеази Bacillus atrophaeus з еластазною і фібриногенолітичною активністю
О. В. Гудзенко1*, Л. Д. Варбанець1, В. О. Чернишенко2,
Є. М. Стогній2, А. М. Остапчук3, В. О. Іваниця3
1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ;
2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
3Одеський національний університет ім. І. І. Мечникова, Одеса, Україна;
*e-mail: alena.gudzenko81@gmail.com
Отримано: 18 вересня 2024; Виправлено: 21 жовтня 2024;
Затверджено: 21 листопада 2024; Доступно онлайн: 17 грудня 2024
Мікробні протеази, які здатні розщеплювати еластин, фібрин, фібриноген і колаген, привертають увагу дослідників через їх значний біотехнологічний потенціал поряд з низькою вартістю виробництва. Раніше ми показали, що Bacillus atrophaeus 08 синтезує позаклітинний протеазний комплекс, який виявляє високу еластолітичну, фібриногенолітичну та фібринолітичну дію, а також незначну казеїнолітичну і колагеназну активність. Метою роботи було виділення та очищення протеази Bacillus atrophaeus 08 із супернатанту культуральної рідини та вивчення її фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності. В експерименті використовували осадження сульфатом амонію 90% насичення, гель-проникну та іонообмінну хроматографію. Згідно з отриманими даними, вихід очищеного ензиму з молекулярною масою близько 30 кДа становив 6%, його еластазна активність зросла в 30 разів (420 од/мг протеїну), а фібриногенолітична активність – у 31,8 раза (350 од/мг протеїну). Крім того, ензим також виявляв фібринолітичну дію (35,3 од/мг протеїну), незначну казеїнолітичну активність (1,2 од/мг протеїну) і відсутність колагеназної активності. Термооптимум гідролізу еластину – 37°С, рН-оптимум 3,0 і 9,0-10,0, термооптимум гідролізу фібриногену – 12°С, рН-оптимум – 4.0. Електрофорез SDS-PAAG показав, що Bβ-ланцюг фібриногену майже не розщеплювався навіть через 1 год інкубації з ензимом, тоді як Аα-ланцюг зникав уже на 30-й хв з утворенням фрагментів із молекулярною масою близько 30-45 кДа. Активність досліджуваного ензимного препарату щодо фібрину була значно нижчою, ніж до фібриногену.
Виділення та характеристика протеаз Bacillus sp. IMB B-7883
О. В. Гудзенко*, Л. Д. Варбанець
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К Заболотного НАН України, Київ;
*e-mail: alena.gudzenko81@gmail.com
Отримано: 20 липня 2023; Виправлено: 12 вересня 2023;
Затверджено: 27 жовтня 2023; Доступно онлайн: 06 листопада 2023
Представники Bacillus є одними з найкращих продуцентів протеаз, вивчених досі, оскільки вони виявляють широку субстратну специфічність, значну активність, стабільність, короткий період ферментації та низьку вартість. Раніше ми показали, що штам Bacillus sp. IMV B-7883 синтезує позаклітинні протеази, які виявляють еластолітичну та фібриногенолітичну активність. Метою роботи було виділення та очищення цих ензимів із культуральної рідини штаму-продуцента Bacillus sp. ІМВ В-7883, а також вивчити їх властивості. Виділення та очищення протеаз проводили осадженням культуральної рідини сульфатом амонію, гель-проникною та іонообмінною хроматографією та рехроматографією на Sepharose 6B. У результаті виділено протеази з еластолітичною та фібриногенолітичною активністю з молекулярною масою 23 та 20 кДа, відповідно, активність еластази зросла у 63,6 раза та фібриногенолітична активність – у 44,1 раза. Ензим з еластазною активністю мав рН-оптимум 7,0 і гідролізував лише еластин, тоді як ензим із фібриногенолітичною активністю був лужною протеазою з рН-оптимумом 8,0 і на додаток до фібриногену виявляв специфічність до фібрину та, у слідових кількостях, до колагену.
Субстратна специфічність α-L-рамнозидаз Cryptococcus albidus і Eupenicillium erubescens
О. В. Гудзенко, Л. Д. Варбанець
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ;
e-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Досліджено субстратну специфічність α-L-рамнозидаз Cryptococcus аlbidus та Eupenicillium еrubescens. Показано, що ензими здатні гідролізувати синтетичні (n-нітрофенільні похідні моносахаридів) і природні (нарингін, неогесперидин) субстрати. α-L-Рамнозидази діяли на природні субстрати досить ефективно, причому препарат, одержаний з E. erubescens, характеризується вищими значеннями Vmax, ніж ензим C. albidus. Але α-L-рамнозидаза C. albidus виявляє більшу спорідненість до нарингіну і неогесперидину, ніж ензим E. erubescens (Km 0,77 і 3,3 мМ та 5,0 і 3,0 мМ відповідно). Щодо синтетичних похідних моносахаридів, то обидва ензими виявляють вузьку специфічність до природи глікону: α-L-рамнозидаза E. erubescens – прискорює розщеплення тільки n-нітрофеніл-α-L-рамнопіранозиду, Km становить 1,0 мМ, Vmax 120 мкмоль/хв/мг протеїну), а C. albidus – лише n-нітрофеніл-β-D-глюкопіранозиду (Km = 10 мМ, Vmax 5 мкмоль/хв/мг протеїну). Отже, показано, що ензимним препаратам E. erubescens та C. albidus притаманна вельми вузька субстратна специфічність. Здатність препаратів α-L-рамнозидаз E. erubescens і C. albidus гідролізувати природні субстрати: нарингін та неогесперидин свідчить про їхню специфічність дії до α-1,2-зв’язаної L-рамнози. На основі цих даних можна прогнозувати використання α-L-рамнозидаз E. erubescens і C. albidus в різних галузях промисловості, зокрема харчовій. Це підтверджується також тим, що досліджувані α-L-рамнозидази є стабільними за 20%-ї концентрації етанолу та 500 мМ глюкози в реакційній суміші.
Мікробні α-амілази: фізико-хімічні властивості, субстратна специфічність та доменна структура
К. В. Авдіюк, Л. Д. Варбанець
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ;
e-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
В огляді наведено сучасні дані літератури та результати власних досліджень щодо продуцентів, фізико-хімічних властивостей та субстратної специфічності α-амілаз, які продукуються мікроорганізмами різних таксономічних груп: бактеріями, грибами та дріжджами. Cинтез більшості α-амілаз є індукованим процесом, який стимулюється у присутності крохмалю або продуктів його гідролізу. Оптимізацією умов культивування штамів-продуцентів можна досягти підвищення рівня активності ензимів. α-Амілази, виділені з різних джерел, відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями, зокрема молекулярною масою, рН- та термооптимумом, інгібіторами і активаторами. Вони здатні гідролізувати α-1,4- та в деяких випадках α-1,6-зв’язані залишки глюкози в розчинному крохмалі, амілозі, амілопектині, глікогені, мальтодекстринах, α- і β-циклодекстринах та інших вуглеводних субстратах. α-Амілази належать до GH-13 родини глікозил-гідролаз, характерною особливістю яких є наявність каталітичного домену A у вигляді (β/α)8-циліндра. Крім домену А, у структурі α-амілаз присутні ще два домени: В і С, які розташовані приблизно з протилежних боків (β/α)8-циліндра. Переважна більшість відомих α-амілаз містять у своєму складі Ca2+, який знаходиться на поверхні між доменами А і В та відіграє важливу роль у стабільності та активності ензиму.
Протеолітична активність IgG сироватки крові щурів лінії Wistar за експериментального ревматоїдного артриту
Ю. Я. Кіт1, С. Л. Мироновський3, І. Й. Кріль2,
А. М. Гаврилюк2, В. В. Чоп’як2, Р. С. Стойка1
1Інститут біології клітини НАН України, Львів;
2Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
3Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
e-mail: kit@cellbiol.lviv.ua
Метою роботи було дослідити протеолітичну активність IgG сироватки крові щурів лінії Wistar за експериментального ревматоїдного артриту (ЕРА), індукованого колагеном бика II типу. Для цього 20 щурів імунізували препаратом колагену бика II типу (Sigma Aldrich, США) у присутності ад’юванта Фрейнда. Розвиток ЕРА визначали за запаленням кінцівок у піддослідних тварин. Препарати IgG виділяли із сироватки крові імунізованих і неімунізованих тварин, осадженням антитіл 33%-им розчином сульфату амонію з наступною хроматографією на протеїн-G-сефарозній колонці. Як субстрати протеолітичної активності антитіл використовували: колаген бика II типу, гістони тимуса теляти, основний протеїн мієліну (ОПМ), БСА, коров’ячий казеїн. Встановлено, що препарати IgG сироватки крові щурів із ЕРА здатні гідролізувати гістон Н1, ОПМ, але каталітично неактивні щодо колагену II типу, казеїну, БСА та корових гістонів. IgG сироватки крові неімунізованих щурів не виявляли протеолітичну активність до жодного із цих протеїнових субстратів. Одержані нами дані вказують на те, що за колагеніндукованого артриту у сироватці крові щурів з’являються IgG-антитіла, які виявляють протеолітичну активність щодо гістону Н1 і ОПМ, що може бути пов’язано із розвитком запальних процесів в імунізованих щурів.