Ukr.Biochem.J. 2021; Том 93, № 6, листопад-грудень, c. 31-45

doi: https://doi.org/10.15407/ubj93.06.031

Одержання рекомбінантних протеїнів коронавірусу SARS-COV-2 та злитого кон’югату із дифтерійним токсоїдом CRM197

04.01.2022   Uncategorized   No comments

О. І. Криніна1, С. І. Романюк1, О. Б. Горбатюк1,2, О. Г. Корчинський1,3,4,
А. В. Ребрієв1, Я. С. Кулик1, Є. О. Козадаєва1, А. А. Сіромолот1,5,
М. М. Гузик1, Д. В. Колибо1*, С. В. Комісаренко1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України», Київ;
3Центр інноваційних біомедичних досліджень і медичний факультет Жешувського університету, Жешув, Польща;
4Національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С. З. Гжицького, Львів, Україна;
5ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
*e-mail: kolibo@biochem.kiev.ua

Отримано: 10 жовтня 2021; Затверджено: 12 листопада 2021

Швидке поширення у світі пандемії COVID-19, спричиненої коронавірусом SARS-CoV-2, виявило нагальну потребу у розробці захисних вакцин для боротьби з цим захворюванням. Тому створення ефективних продуцентів рекомбінантних протеїнів коронавірусу SARS-CoV-2 стало актуальним завданням, вирішення якого сприятиме вивченню функціональних властивостей SARS-CoV-2, а також появі в Україні вакцини власного виробництва проти COVID-19, що має важливе стратегічне значення для боротьби з пандемією. Метою роботи було створити прокаріотичні та евкаріотичні продуценти рекомбінантних протеїнів коронавірусу SARS-CoV-2 і виділити протеїн нуклеокапсиду (N), рецепторзв’язувальний домен (RBD) протеїну «шипа» (S) і злитий кон’югат RBD-домену із носієм – дифтерійним токсоїдом CRM197. Для цього за допомогою методів молекулярної біології та генної інженерії створено відповідні генетичні конструкції, зокрема нездатні до самостійної реплікації аденовірусні вектори на основі AdvC5, що експресують протеїни SARS-CoV-2 і злитий кон’югат. Правильність будови конструкцій підтверджено результатами рестрикційного аналізу та/або секвенування ДНК. Рекомбінантні протеїни було виділено за допомогою металоафінної хроматографії, відповідність їх властивостей підтверджено результатами електрофорезу в поліакриламідному гелі, вестерн-блотингу, імуноензимного аналізу та MALDI-TOF мас-спектрометрії. У результаті було створено продуценти рекомбінантних протеїнів коронавірусу SARS-CoV-2 та злитого кон’югату на основі бактеріального штаму E. coli Rosetta (DE3) та клітинної лінії НЕК293, а також виділено у чистому вигляді протеїн N, RBD-домен протеїну S і злитий протеїн RBD-CRM197. Одержані рекомбінантні протеїни можуть бути використані для вивчення імуногенних і антигенних властивостей протеїнів коронавірусу SARS-CoV-2, а створені продуценти цих протеїнів здатні забезпечити дешевий і безпечний синтез антигенних субстанцій для розробки та виробництва вітчизняних імунодіагностикумів і вакцин проти COVID-19.

Ключові слова: , , , , , ,

Посилання:

  1. Komisarenko S. The global coronavirus crisis. K.: LAT&K, 2020. 120 p. (In Ukrainian).
  2. COVID-19 dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University (JHU). Available at https://coronavirus.jhu.edu/map.html (accessed, November 7, 2021).
  3. World Health Organization. COVID-19 vaccine tracker and landscape. Available at https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines (accessed, November 5, 2021).
  4. PFIZER and BIONTECH achieve first authorization in the world for a vaccine to combat COVID19. https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/pfizer-and-biontech-achieve-first-authorization-world (accessed, December 2, 2020).
  5. Zimmer C, Corum J, Wee S-L. Coronavirus vaccine tracker. Available at https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (accessed, November 4, 2021).
  6. Corum J, Zimmer C. How the Novavax vaccine works. Available at https://www.nytimes.com/interactive/2020/health/novavax-covid-19-vaccine.html (accessed, May 7, 2021).
  7. Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, Abiona O, Graham BS, McLellan JS. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020;367(6483):1260-1263. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  8. Ahlén G, Frelin L, Nikouyan N, Weber F, Höglund U, Larsson O, Westman M, Tuvesson O, Gidlund EK, Cadossi M, Appelberg S, Mirazimi A, Sällberg M. The SARS-CoV-2 N Protein Is a Good Component in a Vaccine. J Virol. 2020;94(18):e01279-20. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  9. Malito E , Bursulaya B, Chen C, Lo Surdo P, Picchianti M, Balducci E, Biancucci M, Brock A, Berti F, Bottomley MJ, Nissum M, Costantino P, Rappuoli R, Spraggon G. Structural basis for lack of toxicity of the diphtheria toxin mutant CRM197. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(14):5229-5234. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  10. Bröker M, Berti F, Schneider J, Vojtek I. Polysaccharide conjugate vaccine protein carriers as a “neglected valency” – Potential and limitations. Vaccine. 2017;35(25):3286-3294. PubMed, CrossRef
  11. Jaffe J, Wucherer K, Sperry J, Zou Q, Chang Q, Massa MA, Bhattacharya K, Kumar S, Caparon M, Stead D, Wright P, Dirksen A, Francis MB. Effects of Conformational Changes in Peptide-CRM 197 Conjugate Vaccines. Bioconjug Chem. 2019;30(1):47-53. PubMed,  CrossRef
  12. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979;7(6):1513-1523. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  13. Labyntsev AJ, Korotkevych NV, Manoilov KJ, Kaberniuk AA, Kolybo DV, Komisarenko SV. Recombinant fluorescent models for studying the diphtheria toxin. Russ J Bioorganic Chem. 2014;40(4):401-409. PubMed, CrossRef
  14. Heckman KL, Pease LR. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc. 2007;2(4):924-932. PubMed, CrossRef
  15. Rudolph R, Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J. 1996;10(1):49-56. PubMed
  16. Basu A, Li X, Leong SSJ. Refolding of proteins from inclusion bodies: rational design and recipes. Appl Microbiol Biotechnol. 2011;92(2):241-251. PubMed,  CrossRef
  17. Schägger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987;166(2):368-379. PubMed, CrossRef
  18. Expasy Swiss Bioinformatics Resource Portal. https://www.expasy.org (accessed, November 5, 2021).
  19. Protein Data Bank. https://www.rcsb.org (accessed, November 5, 2021).
  20. Quitterer U, Pohl A, Langer A, Koller S, Abdalla S. A cleavable signal peptide enhances cell surface delivery and heterodimerization of Cerulean-tagged angiotensin II AT1 and bradykinin B2 receptor. Biochem Biophys Res Commun. 20110;409(3):544-549. PubMed, CrossRef
  21. Yu K, Liu C, Kim BG, Lee DY. Synthetic fusion protein design and applications. Biotechnol Adv. 2015;33(1):155-164. PubMed, CrossRef
  22. Grant OC, Montgomery D, Ito K, Woods RJ. Analysis of the SARS-CoV-2 spike protein glycan shield reveals implications for immune recognition. Sci Rep. 2020;10(1):14991. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  23. Supekar NT, Shajahan A, Gleinich AS, Rouhani DS, Heiss C, Chapla DG, Moremen KW, Azadi P. Variable posttranslational modifications of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 nucleocapsid protein. Glycobiology. 2021;31(9):1080-1092. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  24. Zhao Q, Gao Y, Xiao M, Huang X, Wu X. Synthesis and immunological evaluation of synthetic peptide based anti-SARS-CoV-2 vaccine candidates. Chem Commun (Camb). 2021;57(12):1474-1477. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
  25. Bellone ML, Puglisi A, Dal Piaz F, Hochkoeppler A. Production in Escherichia coli of recombinant COVID-19 spike protein fragments fused to CRM197. Biochem Biophys Res Commun. 2021;558:79-85. PubMed, PubMedCentral,  CrossRef
Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.