Ukr.Biochem.J. 2022; Том 94, № 5, вересень-жовтень, c. 7-17

doi: https://doi.org/10.15407/ubj94.05.007

Очистка та характеристика інгібітора агрегації тромбоцитів з отрути Bitis arietans

20.01.2023   Uncategorized   No comments

O. Платонов1*, В. Нікуліна1, Є. Кучерявий1, В. Грищук1,
Є. Стогній1, В. Черенишенко1, O. Сломінський1,
A. Ребрієв1, K. Савченко1,2, Л. Гарманчук2

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2ННЦ “Інститут біології та медицини”,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
*e-mail: chaosplaton@gmail.com

Отримано: 28 січня 2022; Виправлено: 03 жовтня 2022;
Затверджено: 20 вересня 2022; Доступно онлайн: 19 грудня 2022

Дезінтегрини – антагоністи інтегринових рецепторів, які отримують з отрути змій. Вони інгібують агрегацію тромбоцитів, тим самим перешкоджаючи формуванню кров’яного згустку. Відомо, що дезінтегрини, блокуючи інтегрин-опосередковані взаємодії пухлинних клітин, можуть пригнічувати їхню проліферацію та метастазування. Отже, пошук нових джерел дезінтегринів та розробка методів їх очистки є важливим завданням сучaсної біотехнології. Цю роботу присвячено очистці та характеристиці дезінтегринів отрути Bitis arietans. Цільну отруту B. аrietans фракціонували методом іонообмінної хроматографії на Q Sepharose з наступною очисткою гель-фільтрацією на Superdex 75, використовуючи FPLC. Аналіз молекулярної маси протеїнових компонентів виконаний методами гель-електрофорезу та MALDI-TOF аналізу на Voyager-DE (Applied Biosystems, США). Агрегацію збагаченої тромбоцитами плазми крові (ЗТПК) за присутності інгібітора агрегації тромбоцитів проводили методом агрегатометрії на AR2110. MTT-тест було виконано для оцінки проліферативної активності та життєздатності клітин лінії HeLa in vitro. Двоетапна хроматографія дозволила нам отримати фракції, які містять поліпептид із дозозалежною інгібіторною дією на ADP-індуковану агрегацію тромбоцитів у ЗТПК. Гель-електрофорез показав, що отримана фракція містить 2 поліпептиди з молекулярною масою 9,0 та 13,67 кДа відповідно до результатів MALDI-TOF аналізу. Очищені поліпептиди інгібували АDP-індуковану агрегацію тромбоцитів (IC50 = 0,09 мг/мл). Відповідно до результатів МТТ-тесту, фракція дезінтегринів (0,005 мг/мл) пригнічувала життєздатність пухлинних клітин лінії HeLa на 20%. Зроблено висновок про можливість використання отриманих поліпептидів як антитромботичних та антипроліферативних агентів.

Ключові слова: , , , ,

Посилання:

  1. Cañas CA, Castaño-Valencia S, Castro-Herrera F, Cañas F, Tobón GJ. Biomedical applications of snake venom: from basic science to autoimmunity and rheumatology. J Transl Autoimmun. 2020;4:100076. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  2. Huang TF, Hsu CC, Kuo YJ. Anti-thrombotic agents derived from snake venom proteins. Thromb J. 2016;14(Suppl 1):18. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  3. Trikha M, Rote WE, Manley PJ, Lucchesi BR, Markland FS. Purification and characterization of platelet aggregation inhibitors from snake venoms. Thromb Res. 1994;73(1):39-52. PubMed, CrossRef
  4. Mohamed Abd El-Aziz T, Garcia Soares A, Stockand JD. Snake Venoms in Drug Discovery: Valuable Therapeutic Tools for Life Saving. Toxins (Basel). 2019;11(10):564. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  5. Vasconcelos AA, Estrada JC, David V, Wermelinger LS, Almeida FCL, Zingali RB. Structure-Function Relationship of the Disintegrin Family: Sequence Signature and Integrin Interaction. Front Mol Biosci. 2021;8:783301. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  6. Akhtar B, Muhammad F, Sharif A, Anwar MI. Mechanistic insights of snake venom disintegrins in cancer treatment. Eur J Pharmacol. 2021;899:174022. PubMed, CrossRef
  7. Schönthal AH, Swenson SD, Chen TC, Markland FS. Preclinical studies of a novel snake venom-derived recombinant disintegrin with antitumor activity: A review. Biochem Pharmacol. 2020;181:114149. PubMed, CrossRef
  8. Dingwoke EJ, Adamude FA, Mohamed G, Klein A, Salihu A, Abubaker MS, Sallau AB. Venom proteomic analysis of medically important Nigerian viper Echis ocellatus and Bitis arietans snake species. Biochem Biophys Rep. 2021;28:101164. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  9. Strydom MA, Bester J, Mbotwe S, Pretorius E. The effect of physiological levels of South African puff adder (Bitis arietans) snake venom on blood cells: an in vitro model. Sci Rep. 2016;6:35988. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  10. Megale ÂAA, Magnoli FC, Kuniyoshi AK, Iwai LK, Tambourgi DV, Portaro FCV, da Silva WD. Kn-Ba: a novel serine protease isolated from Bitis arietans snake venom with fibrinogenolytic and kinin-releasing activities. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis. 2018;24:38. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  11. Chernyshenko V, Shteinberg K, Lugovska N, Ryzhykova M, Platonova T, Korolova D, Lugovskoy E. Preparation of highly-concentrated autologous platelet-rich plasma for biomedical use. Ukr Biochem J. 2019;91(2):19-27. CrossRef
  12. Kielkopf CL, Bauer W, Urbatsch IL. Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2021;2021(12).
    PubMed, CrossRef
  13. Yang H, Liu N, Qiu X, Liu S. A new method for analysis of disulfide-containing proteins by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2009;20(12):2284-2293. PubMed, CrossRef
  14. Gryshchuk V, Galagan N. Silica Nanoparticles Effects on Blood Coagulation Proteins and Platelets. Biochem Res Int. 2016;2016:2959414. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  15. Gao W, Chen SR, Wu MY, Gao K, Li YL, Wang HY, Li CY, Li H. Methylprednisolone exerts neuroprotective effects by regulating autophagy and apoptosis. Neural Regen Res. 2016;11(5):823-828. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  16. Bradford MM. A rаpid and sensitive method for quantities of utilizing the principle of protein binding. Anal Biochem. 1976; 72(1-2): 248-254.
    PubMed, CrossRef
  17. McLane MA, Sanchez EE, Wong A, Paquette-Straub C, Perez JC. Disintegrins. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 2004;4(4):327-355. PubMed, CrossRef
  18. Sanchez EF, Flores-Ortiz RJ, Alvarenga VG, Eble JA. Direct Fibrinolytic Snake Venom Metalloproteinases Affecting Hemostasis: Structural, Biochemical Features and Therapeutic Potential. Toxins (Basel). 2017;9(12):392. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  19. de Oliveira IS, Manzini RV, Ferreira IG, Cardoso IA, Bordon KCF, Machado ART, Antunes LMG, Rosa JC, Arantes EC. Cell migration inhibition activity of a non-RGD disintegrin from Crotalus durissus collilineatus venom. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis. 2018;24:28. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  20. Rivas Mercado E, Neri Castro E, Bénard Valle M, Rucavado-Romero A, Olvera Rodríguez A, Zamudio Zuñiga F, Alagón Cano A, Garza Ocañas LG. Disintegrins extracted from totonacan rattlesnake (Crotalus totonacus) venom and their anti-adhesive and anti-migration effects on MDA-MB-231 and HMEC-1 cells. Toxicol In Vitro. 2020;65:104809. PubMed, CrossRef
  21. Ebrahim K, Vatanpour H, Zare A, Shirazi FH, Nakhjavani M. Anticancer Activity a of Caspian Cobra (Naja naja oxiana) snake Venom in Human Cancer Cell Lines Via Induction of Apoptosis. Iran J Pharm Res. 2016;15(Suppl):101-112. PubMed, PubMedCentral
  22. Selistre-de-Araujo HS, Cominetti MR, Terruggi CHB, Mariano-Oliveira A, De Freitas MS, Crepin M, Figueiredo CC, Morandi V. Alternagin-C, a disintegrin-like protein from the venom of Bothrops alternatus, modulates alpha2beta1 integrin-mediated cell adhesion, migration and proliferation. Braz J Med Biol Res. 2005;38(10):1505-1511. PubMed, CrossRef
  23. Huang TF, Liu CZ, Ouyang CH, Teng CM. Halysin, an antiplatelet Arg-Gly-Asp-containing snake venom peptide, as fibrinogen receptor antagonist. Biochem Pharmacol. 1991;42(6):1209-1219. PubMed, CrossRef
  24. Clark EA, Trikha M, Markland FS, Brugge JS. Structurally distinct disintegrins contortrostatin and multisquamatin differentially regulate platelet tyrosine phosphorylation. J Biol Chem. 1994;269(35):21940-21943. PubMed
  25. Chernyshenko V, Petruk N, Korolova D, Kasatkina L, Gornytska O, Platonova T, Chernyshenko T, Rebriev A, Dzhus O, Garmanchuk L, Lugovskoy E. Antiplatelet and anti-proliferative action of disintegrin from Echis multisquamatis snake venom. Croat Med J. 2017;58(2):118-127. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  26. Swenson S, Costa F, Ernst W, Fujii G, Markland FS. Contortrostatin, a snake venom disintegrin with anti-angiogenic and anti-tumor activity. Pathophysiol Haemost Thromb. 2005;34(4-5):169-176. PubMed, CrossRef
  27. Hong SY, Koh YS, Chung KH, Kim DS. Snake venom disintegrin, saxatilin, inhibits platelet aggregation, human umbilical vein endothelial cell proliferation, and smooth muscle cell migration. Thromb Res. 2002;105(1):79-86. PubMed, CrossRef
  28. Higuchi DA, Almeida MC, Barros CC, Sanchez EF, Pesquero PR, Lang EAS, Samaan M, Araujo RC, Pesquero JB, Pesquero JL. Leucurogin, a new recombinant disintegrin cloned from Bothrops leucurus (white-tailed-jararaca) with potent activity upon platelet aggregation and tumor growth. Toxicon. 2011;58(1):123-129. PubMed, CrossRef
  29. Kuo YJ, Chung CH, Pan TY, Chuang WJ, Huang TF. A Novel αIIbβ3 Antagonist from Snake Venom Prevents Thrombosis without Causing Bleeding. Toxins (Basel). 2019;12(1):11. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.