Tag Archives: тромбоцити

Параметри зсідання плазми крові щурів із гострою променевою хворобою за умов ентеросорбції

В. Чернишенко1, Є. Снежкова2, М. Мазур2, Т. Чернишенко1,
Т. Платонова1, О. Сидоренко2, Е. Луговськой1, В. Ніколаєв2

1Інститут біохімії ім О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ

Радіаційно-індукована коагулопатія (РІК) є однією з основних причин смерті під час гострої променевої хвороби (ГПХ). Метою цієї статті було охарактеризувати реакцію системи гемостазу на ГПХ помірного рівня на 1-шу і 9-ту добу після опромінення, виявити молекулярні маркери системи зсідання крові, які  найбільше постраждали за ГПХ, та оцінити ефект ентеросорбції на розвиток індукованих опроміненням змін. Рівень агрегації тром­боцитів, активований частково тромбопластиновий час (АЧТЧ) і концентрацію фібриногену визначали стандартними методами. Рівень протеїну C (ПС) вимірювали за допомогою хромогенного субстрату S2366 (p-Glu-Pro-Arg-pNa) та ензиму-активатора з отрути Agkistrodon halys halys. Функціонально неактивні форми протромбіну (ФНФП) визначали, використовуючи паралельно два активатори – тромбопластин та активатор протромбіну з отрути Echis multisqumatis. Щури обох опромінених груп мали підвищений ризик внутрішньосудинного зсідання крові порівняно з обома контрольними групами. Виявлено статистично вірогідне скорочення часу зсідання крові в тесті АЧТЧ (24 ± 4 с порівняно з 33 ± 5 с) і підвищення концентрації фібриногену (4,2 ± 0,6 мг/мл порівняно з 3,2 ± 0,3 мг/мл). Обидва параметри нормалізувалися на 9-ту добу після радіаційного опромінення. Однак кількість тромбоцитів зменшувалася (0.3∙106 ± 0.05∙106 1/мкл порівняно з 0.145∙106 ± 0.04∙106 1/мкл) внаслідок порушення функції мегакаріоцитів. Рівень ПС знижувався після опромінення (70 ± 10%) і частково відновлювався на 9-ту добу (87 ± 10%). Введення щурам активованого вугілля (АВ) запобігало зниженню концентрації ПС після опромінення (86 ± 15%) і прискорювало її відновлення на 9-ту добу (103 ± 14%). Статистично вірогідне накопичення ФНФП було виявлено в плазмі крові опромінених щурів (група 1) на обох досліджуваних етапах. ФНФП не були виявлені у жодного з опромінених щурів, які отримували АВ (група 2). Характеристика системи гемостазу щурів, які піддавалися напівлетальній дозі опромінення, дозволила вибрати параметри, які можуть бути використані для моніторингу розвитку ГПХ. Крім основних коагуляційних тестів (АЧТЧ), вивчення агрега­ції тромбоцитів, рівня фібриногену та протеїна С, виявлення ФНФП може бути рекомендованим як дієвий інструмент для оцінки відповіді системи гемостазу на рентгенівське опромінення. Поява ФНФП свідчить про внутрішньосудинне утворення тромбіну і може вказувати на тромботичні ускладнення або дисеміноване внутрішньосудинне зсідання. Визначення ФНФП у плазмі крові опромінених щурів дозволило вивчити ефект ентеросорбції на розвиток змін, спричинених опроміненням. Показано, що ентеросорбція АВ перешкоджає накопиченню ФНФП. Антитромботичний ефект терапії АВ виявлено вперше. Також встановлено, що ГПХ спричинює активацію системи гемостазу, утворення тромбіну (виявлене за рахунок утворення ФНФП), незначне запалення (на що вказує зниження концентрації ПС) і тромбоцитопенію. Ентеросорбція АВ мінімізує запальні та прокоагулянті процеси, спричинені помірною дозою опромінення. Накопичення ФНФП можна вважати одним із найчутливіших маркерів відповіді системи зсідання крові на опромінення.

Приготування висококонцентрованої аутологічної плазми крові, збагаченої тромбоцитами, для біомедичного використання

В. Чернишенко1, К. Штайнберг2, Н. Луговська1, М. Рижикова1,
Т. Платонова1, Д. Корольова1, Е. Луговськой1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: bio.cherv@gmail.com;
2«Клініка доктора Запольскої», Київ, Україна

Клітинна терапія з використанням тромбоцитів є широко поширеним підходом в медицині для загоєння ран і регенерації тканин. Однак, найдоступніші методи дають змогу отримати не достатньо концентровані суспензії тромбоцитів (до 0,3∙106 1/мкл) або суспензії тромбоцитів, що частково або повністю втратили свою активність. У цьому дослідженні ми поставили за мету розробити простий та ефективний метод приготування суспензії нативних та інтактних тромбоцитів у концентрації понад 1∙106 1/мкл. Збагачену тромбоцитами плазму крові (ЗТПК) отримували зі свіжої крові здорових донорів (n = 5), при заборі крові як антикоагулянт використовували гепарин. Зразки ЗТПК осаджували і ресуспендували в аутологічній плазмі крові. Кількість та життєздатність тромбоцитів у кожному зразку визначали шляхом дослідження агрегації на агрегометрі Solar AP2110. Форма тромбоцитів і гранулярність цитоплазми, які вказують на нативність тромбоцитів, контролювали на потоковому цитометрі COULTER EPICS XL. Дослідження агрегації тромбоцитів у ЗТПК, отриманій з використанням різних кількостей гепарину, дозволило нам знизити кінцеві концентрації до кількості, яка ефективно запобігала зсіданню крові і не впливала на активність тромбоцитів (5 U/мл). ЗТПК, сконцентрована в 5 разів із загальною концентрацією клітин 1∙106 1/мкл, була здатна до активації аденозиндифосфатом (AДФ) (ступінь агрегації 54 ± 7%). Кількість клітин зі зміненою формою та гранулярністю в сконцентрованій суспензії не перевищувала 20%. Ці дані свідчать, про те, що тромбоцити зберігають здатність вивільняти ряд факторів росту та інші біологічно активні сполуки після стимуляції або ін’єкції в тканини за клітинної терапії. Зниження концентрації гепарину до того ж мінімізує крововилив в місці ін’єкції, що сприяє біомедичному застосуванню суспензії. Розроблено простий та ефективний метод приготування високо концентрованої ЗТП (1,2∙106 1/мкл) для біомедичного використання. Агрегатометрія і протокова цитометрія довели, що одержані тромбоцити інтактні й здатні активуватися. Препарат, що є аутологічним,  може бути широко використаний для клітинної терапії без додаткових запобіжних заходів.

Glu- та Lys-форми плазміногену по різному впливають на експонування фосфатидилсерину на поверхні тромбоцитів

Д. Д. Жерносєков, Я. М. Рока-Мойя, A. O. Tихомиров, M. M. Гузик, T. В. Гриненко

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: chemikdd@mail.ru

Плазміноген/плазмінова система відпо­відає за підтримку гемостатичного балансу крові. Водночас плазміноген може виступати як адгезивний ліганд і таким чином впливати на функціонування клітин крові. Нами було показано, що екзогенний Lys-плазміноген, на відміну від Glu-форми, призводить до інгібування тромбоцитарної агрегації та пригнічує секрецію α-гранул тромбоцитів. Мета цієї роботи – дослідити вплив Glu- та Lys-форм плазміногену на формування прокоагулянтної поверхні тромбоцитів, використовуючи як маркер екс­понування фосфатидилсерин на тромбоцитах. Тромбоцити отримували зі збагаченої тромбоцитами плазми (здорові донори-волонтери, чоловіки віком 30–40 років) методом гель-хроматографії на сефарозі 2В. Експонування фосфатидилсерину на поверхні тромбоцитів оцінювали методом протокової цитофлуориметрії за допомогою ФІТЦ-кон’югованого анексину А5. Показано, що Glu- та Lys-форми плазміногену спричиняли різний вплив на функціонування тромбоцитів. Екзогенний Lys-плазміноген не мав істотного впливу на експонування фосфатидилсерину, в той час як Glu-плазміноген за цих умов призводив до підвищеного експонування фосфатидилсерину на поверхні тромбоцитів активованих тромбіном або колагеном. Зроблено висновок щодо можливої ролі Glu-плазміногену як ко-стимулятора агоніст-індукованої секреції тромбоцитів, так і стимулятора формування прокоагулянтної поверхні. Ефекти Lys-плазміногену ймовірно спрямовані на міжтромбоцитарну взаємодію і не пов’язані з агоніст-стимульованими про-апоптичними змінами.  Різний ефект Glu- та Lys- форм плазміногену може бути пояснений структурними особливостями відповідних форм зимогену.

Плазміноген модулює утворення активних форм оксигену тромбоцитами людини

А. О. Тихомиров, Д. Д. Жерносєков, М. М. Гузик, В. В. Корса, Т. В. Гриненко

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: artem_tykhomyrov@ukr.net

Активні форми оксигену (АФО) є важливими сигнальними молекулами, які контролюють функціонування тромбоцитів, а їх продукція підсилюється під час тромбоцитарної активації. Модуляторні ефекти плазміногену (Pg) на утворення АФО тромбоцитами раніше не досліджувалися. Метою цієї роботи було визначити здатність різних форм Pg впливати на метаболічну активність/виживаність тромбоцитів та утворення ними АФО в стані спокою і за умов активації. Тромбоцити, ізольовані із плазми донорів, преінкубували з Glu- або Lys-Pg (1,2 µM) та активували тромбіном (1,0 од. NIH/мл) або колагеном (1,25 мг/мл). Загальну дегідрогеназну активність мітохондрій визначали за допомогою МТТ-тесту, протокову цитофлуориметрію з використанням зонду H2DCF-DA застосовували для вимірювання внутрішньоклітинних рівнів АФО. Встановлено, що Lys-Pg незначним чином пригнічує відновлення МТТ (P < 0,05 проти контролю). Тромбін спричинював дворазове збільшення рівня метаболічної активності тромбоцитів порівняно з інтактними клітинами. Однак активація, індукована тромбіном, була менш вираженою у разі тромбоцитів, преінкубованих з Pg, причому Lys-Pg спричинював більший інгібувальний ефект. На відміну від тромбіну колаген значно пригнічував метаболічну активність тромбоцитів (на 60% від контрольної величини, P < 0,05). Glu- та Lys-Pg не впливали на активність колагенстимульованих тромбоцитів у МТТ-тесті. Сортінг тромбоцитів за здатністю продукувати АФО виявив дві різні субпопуляції клітин. Зростання продукції АФО спостерігалося за активації тромбоцитів як тромбіном, так і колагеном. Pg (Lys-форма більшою мірою) підсилював внутрішньоклітинну генерацію АФО у тромбінстимульованих тромбоцитах. Показано, що посилення Pg генерації АФО, яке передує дії агоністів, може призводити до зниження їх життєздатності та функціональної активності. Це дослідження доповнює уявлення про можливі механізми впливу Pg на функціонування тромбоцитів.

Дія калікс[4]арен-метиленбісфосфонової кислоти С-145 та її сірковмісного аналога на гемостаз

В. О. Чернишенко1, O. В. Савчук1, С. O. Черенок2, O. M. Силенко2,
A. O. Негеля3, Л. О. Касаткіна1, Л. В. Пирогова1, В. А. Дідківський1,
О. І. Юсова1, В. І. Кальченко2, Л. В. Гарманчук3, Т. В. Гриненко1,
Е. В. Луговськой1, С. В. Комісаренко1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
3ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
e-mail: bio.cherv@gmail.com

С-145 (октанатрієва сіль калікс[4]арен-тетра-метиленбісфосфонової кислоти) було раніше обрано як специфічний антикоагулянтний агент, який пригнічує полімеризацію фібрину, не маючи відчутного впливу на інші параметри системи зсідання крові. Оскільки C-145S (октанатрієва сіль калікс[тіа-4]арен-тетра-метиленбісфосфонової кислоти) має більшу гідрофобну чашу, можна очікувати його більшу антиполімеризаційну активність, порівняно із С-145. Метою цієї роботи було порівняння дії обох органічних сполук на полімеризацію фібрину, фібриноліз, агрегацію тромбоцитів та проліферацію ендотеліоцитів. Полімеризацію фібринового згустку в плазмі крові за дії АЧТЧ-реагенту та гідроліз фібринового згустку за дії тканинного активатора плазміногену в присутності С-145 та С-145S вивчали за допомогою турбідиметричного аналізу. Ефект С-145 та С-145S на активацію Glu-плазміногену стрептокіназою визначали за допомогою хромогенного субстрату S2251, а агрегацію тромбоцитів – за допомогою агрегатометрії. Стимульований викид Ca2+ з ендоплазматичного ретикулума та цитоплазми вивчали за допомогою спектрофлуориметрії із застосуванням специфічних флуоресцентних зондів Mag-Fluo-4 та FURA-2. Як С-145, так і C-145S знижувала кінцеву мутність згустку і подовжувала час напівлізису згустку в плазмі крові людини. Однак у модельній системі з полімерним фібрином desAB С-145 виявився ефективнішим інгібітором фібринолізу. C-145S, але не C-145, індукував зміни концентрації Ca2+ в цитоплазмі тромбоцитів у стані спокою, а також вірогідно інгібував (на 30%) викид Ca2+ з ендоплазматичного ретикулума тромбоцитів, активованих ADP. Як C-145, так і C-145S стимулювали проліферацію ендотеліальних клітин свині (РАЕ). Таким чином, показано, що калікс[4]арен C-145S був ефективнішим інгібітором полімеризації фібрину порівняно з С-145, який раніше було обрано для створення антикоагулянтного агента. C-145S також виявляв вираженіший інгібіторний ефект на кальцієвий сигналінг тромбоцитів і стимулюючий ефект на проліферацію ендотеліоцитів. Отже, С-145 виявився перспективнішою молекулярною платформою для створення антитромботичного агента.

Динаміка тромбініндукованного експонування актину на поверхні тромбоцитів

А. О. Тихомиров

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: artem_tykhomyrov@ukr.net

Тромбоцити відіграють ключову роль у процесах тромбоутворення, а також залучаються до регуляції ангіогенезу, імунної відповіді та репаративних процесів. Під час свого функціонування тромбоцити зазнають складних змін, при цьому субклітинні структури, які не виявляються у стані фізіологічного спокою, експонуються на поверхню тромбоцитів після їхньої активації агоністами. Метою цього дослідження було оцінити динамічні характеристики експонування актину на поверхні плазматичної мембрани тромбінактивованих тромбоцитів. За допомогою протокової цитометрії показано, що рівень актину, який представляють активовані тромбоцити, безпосередньо залежить від концентрації агоніста. Зокрема, стимулювання тромбоцитів тромбіном (1.0 U/ml) призвело до збільшення рівня експонування актину у 4,4 раза у порівнянні з неактивованими клітинами. Встановлено, що інтенсивність експонування актину прямо залежить як від концентрації тромбіну, так і від часу інкубації з агоністом. Результати, одержані за допомогою протокової цитометрії, було підтверджено в ході безпосередньої візуалізації поверхневого антигену з використанням конфокальної лазерної скануючої мікроскопії. Функціональне значення поверхневого актину тромбоцитів потребує подальших досліджень, однак, припускається, що актин, локалізований на плазматичній мембрані, може взаємодіяти з різними протеїнами плазми, виступаючи як сайтом зв’язування, так і/або центром їх позаклітинного процесингу.

Пошук сполук з антиагрегаційною активністю серед S-естерів тіосульфокислот

Т. І. Галенова1, І. В. Ніколаєва1, А. В. Наконечна2,
Х. Б. Болібрух2, Н. Я. Монька2, В. І. Лубенець2,
О. М. Савчук1, В. П. Новіков2, Л. І. Остапченко1

1ННЦ «Інститут біології», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
2Національний університет «Львівська політехніка», Україна;
е-mail: galenovatanya@rambler.ru

Згідно із сучасними уявленнями, гіперактивація тромбоцитарної ланки системи гемостазу може призводити до підвищення внутрішньосудинного зсідання крові та тромбоутворення. Сьогодні актуальним питанням є пошук нових антитромботичних агентів, які здатні впливати на активність тромбоцитарних рецепторів, і, тим самим, регулювати процеси активації та агрегації тромбоцитів. Метою цього дослідження було вивчення впливу новосинтезованих похідних тіосульфонатів на процес агрегації тромбоцитів. Активність сполук перевірена в експериментах in vitro з використанням багатої на тромбоцити плазми. Внаслідок проведеного скринінг-тесту встановлено структурні формули чотирьох агентів, що мали високу антиагрегаційну активність. Ці сполуки дозозалежним чином інгібували АDP- та колагеніндуковану агрегацію тромбоцитів. Показано, що із досліджених сполук дві є най­ефективними інгібіторами агрегації, спричиненої АDP (IC50 ~ 8–10 мкM), а також колагеном (IC50 ~ 1,5–2,0 мкM).