Ukr.Biochem.J. 2022; Том 94, № 2, березень-квітень, c. 76-84

doi: https://doi.org/10.15407/ubj94.02.076

Аналіз профілю молекулярної маси хітозану методом електрофорезу в ступінчастому градієнті пористості поліакриламідного гелю

18.07.2022   Uncategorized   No comments

М. Д. Луцик1*, Н. О. Манько1, Р. О. Білий2,
М. М. Луцик2 (мол.), Р. С. Стойка1

1Інститут біології клітини НАН України, Львів;
2Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Україна;
*e-mail: lootsikmaxim@gmail.com

Отримано: 12 квітня 2021; Затверджено: 01 липня 2022

Хітозан є біосумісним і здатним до біодеградації природним біополімером, який широко застосовується у різних галузях біології, медицини і фармації, проте його біологічна дія суттєво залежить від ступеня полімеризації (DP) та ступеня деацетилювання (DDA) полімерних ланцюгів. Оцінка ланцюгів хітозану за показником DP потребує застосування вартісного методу високоефективної ексклюзійної хроматографії (HP-SEC). Метою нашого дослідження було визначення профілю молекулярної маси зразків хітозану шляхом електрофорезу у ступінчастому градієнті пористості поліакриламідного гелю, а також оцінка ефективності цього методу для моніторингу очищення фрагментів хітозану і його похідних. Застосували 2 типи гелів із ступінчастим градієнтом пористості: 1) гель із шарами акриламіду концентрації 2,5; 3,5; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0% w/v для нативного хітозану або його високомолекулярних фрагментів; 2) гель із шарами акриламіду концентрації 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0% w/v для низькомолекулярних фрагментів хітозану. Переважна кількість молекул із пулу хітозану локалізувалась у гелі типу 1 у області 550-40 кДа та розподілялась між трьома бендами, які у різних зразках значно відрізнялись за відсотковим співвідношенням. Електрофорез фрагментів хітозану, фракціонованих із допомогою гель-проникної хроматографії, забезпечував чітке розділення фрагментів середньої молекулярної маси (50-400 кДа) у гелі типу 1 та низькомолекулярних фрагментів (3-40 кДа) у гелі типу 2. Отже, розроблено метод електрофорезу хітозану у ступінчастому градієнті пористості поліакриламідного гелю, який дозволяє охарактеризувати молекулярну масу полімерних ланцюгів у зразках хітозану, а також є ефективним у моніторингу очищення фрагментів хітозану з молекулярною масою в діапазоні від 3 до 400 кДа, отриманих методом гель-проникної хроматографії.

Ключові слова: , , , ,

Посилання:

  1. Dai T, Tanaka M, Huang YY, Hamblin MR. Chitosan preparations for wounds and burns: antimicrobial and wound-healing effects. Expert Rev Anti Infect Ther. 2011;9(7):857-879. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  2. Kulkarni AD, Patel HM, Surana SJ, Vanjari YH, Belgamwar VS, Pardeshi CV. N,N,N-Trimethyl chitosan: An advanced polymer with myriad of opportunities in nanomedicine. Carbohydr Polym. 2017;157:875-902. PubMed, CrossRef
  3. Zhao D, Yu S, Sun B, Gao S, Guo S, Zhao K. Biomedical Applications of Chitosan and Its Derivative Nanoparticles. Polymers (Basel). 2018;10(4):462. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  4. Mnatsakanyan M, Thevarajah JJ, Roi RS, Lauto A, Gaborieau M, Castignolles P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal Bioanal Chem. 2013;405(21):6873-6877. PubMed, CrossRef
  5. Wu C, Kao CY, Tseng SY, Chen KC, Chen SF. Determination of the degree of deacetylation of chitosan by capillary zone electrophoresis. Carbohydr Polym. 2014;111:236-244. PubMed, CrossRef
  6. Yomota C, Miyazaki T, Okada S. Determination of the viscometric constants for chitosan and the application of universal calibration procedure in its gel permeation chromatography. Colloid Polym Sci. 1993;271(1):76-82. CrossRef
  7. Berth G, Dautzenberg H. The degree of acetylation of chitosans and its effect on the chain conformation in aqueous solution. Carbohydr Polym. 2002;47(1):39-51. CrossRef
  8. Ottøy MH, Vårum KM, Christensen BE, Anthonsen MW, Smidsrød O. Preparative and analytical size-exclusion chromatography of chitosans. Carbohydr Polym. 1996;31(4): 253-261. CrossRef
  9. Bahrke S, Einarsson JM, Gislason J, Haebel S, Letzel MC, Peter-Katalinić J, Peter MG. Sequence analysis of chitooligosaccharides by matrix-assisted laser desorption ionization postsource decay mass spectrometry. Biomacromolecules. 2002;3(4):696-704. PubMed, CrossRef
  10. Nguyen S, Hisiger S, Jolicoeur M, Winnik FM, Buschmann MD. Fractionation and characterization of chitosan by analytical SEC and 1H NMR after semi-preparative SEC. Carbohydr Polym. 2009;75(9):636-645. CrossRef
  11. Blagodatskikh IV, Kulikov SN, Vyshivannaya OV, Bezrodnykh EA, Tikhonov VE. N-Reacetylated oligochitosan: pH dependence of self-assembly properties and antibacterial activity. Biomacromolecules. 2017;18(5):1491-1498. PubMed, CrossRef
  12. Kang Y, Wu X, Ji X, Bo S, Liu Y. Strategy to improve the characterization of chitosan by size exclusion chromatography coupled with multi angle laser light scattering. Carbohydr Polym. 2018;202:99-105. PubMed, CrossRef
  13. Audy P, Asselin A. Gel elctrophoretic analysis of chitosan hydrolytic products. Electrophoresis. 1992; 13(1): 334-337. PubMed, CrossRef
  14. Lootsik MD, Bilyy RA, Lutsyk MM, Stoika RS. Preparation of chitosan with high blood clotting activity and its hemostatic potential assessment. Biotechnologia Acta. 2015;8(6):32-40. CrossRef
  15. Lootsik MD, Bilyy RO, Lutsyk MM, Manko NO, Navytka SA, Kutsiaba VI, Stoika R. S. Honeybee (Apis mellifera) chitosan: purification, heterogeneity and hemocoagulating activity. Biotechnologia Acta. 2016;9(6):39-49. CrossRef
  16. Immunoglobulin Structure and Classes. Regime of access : https://www.thermofisher.com/ua/en/home/life-science/antibodies/antibodies-learning-center/antibodies-resource-library/antibody-methods/immunoglobulin-structure-classes.html.
  17. Immunoglobulin A. Regime of access : https://en.wikipedia.org/wiki/Immunoglobulin_A
  18. Ban E, Choi OK, Ryu JC, Yoo YS. Capillary electrophoresis of high-molecular chitosan: the natural carbohydrate biopolymer. Electrophoresis. 2001;22(11):2217-2221. PubMed, CrossRef
  19. Beaudoin ME, Gauthier J, Boucher I, Waldron KC. Capillary electrophoresis separation of a mixture of chitin and chitosan oligosaccharides derivatized using a modified fluorophore conjugation procedure. J Sep Sci. 2005;28(12):1390-1398. PubMed, CrossRef
  20. Wang CY, Hsieh YZ. Analysis of chitin oligosaccharides by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence. J Chromatogr A. 2002;979(1-2):431-438. PubMed, CrossRef
Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.