Tag Archives: мітохондрії

Джерела і закономірності синтезу оксиду азоту в клітинах гладенького м’яза матки

Г. В. Данилович, Ю. В. Данилович, Т. В. Богач,
В. Т. Гурська, С. О. Костерін

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua

Отримано: 28 лютого 2019; Затверджено: 17 травня 2019

Доведено, що синтез NO в ізольованих мітохондріях гладенького м’яза матки щурів є залежним від надходження екзогенного Са2+ до мітохондрій (інгібується 1–10 мМ Mg2+ за відсутності АТР, 10 мкМ рутенієвим червоним), пригнічується антагоністами кальмодуліну (0,1–10 мкМ кальмідозоліумом та 1–100 мкМ трифлуоперазином). Він блокується відомим антагоністом конститутивних NO-синтаз NG-нітро-L-аргініном з ефектом полумаксимального інгібування близько 25 мкМ. Помірна дехолестеринізація плазматичної мембрани міоцитів за їх обробки 0,01%-им дигітоніном приводить до зростання синтезу NO клітинами, що свідчить на користь того, що плазмалема є можливим джерелом NO в міоцитах матки.

Ефекти калікс[4]арен­халконамідів на мітохондрії міометрія

С. Г. Шликов1, А. М. Кушнарьова-Вакал1, А. В. Силенко1, Л. Г. Бабіч1,
О. Ю. Чуніхін1, О. А. Єсипенко2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: sshlykov@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ

Отримано: 19 листопада 2018; Затверджено: 14 березня 2019

Мітохондрії відіграють ключову роль у найважливіших функціях клітин. Каліксарени – це супрамолекулярні сполуки, які широко застосовуються в біоорганічній хімії та біохімії. Мета цієї роботи – дослідити ефекти калікс[4]аренів, які містять у своїй структурі дві (С-1012 і С-1021), три (С 1023 і С-1024) та чотири (С-1011) халконамідні групи, на поляризацію мембран мітохондрій міометрія, на рівень іонізованого Са в матриксі цих органел та на середній гідродинамічний діаметр мітохондрій. Встановлено, що інкубація пермеабілізованих клітин міометрія з калікс[4]аренами, що містять від двох до чотирьох халконамідних груп супроводжується збільшенням рівня поляризації мембран мітохондрій міометрія. Відомо, що акумуляція Са2+ в мітохондріях є потенціалзалежним процесом. Отже, подальші експерименти було спрямовано на дослідження впливу калікс[4]аренхалкон­амідів на концентрацію іонізованого Са в матриксі мітохондрій ([Ca2+]m). Усі досліджувані калікс[4]арени збільшували рівень іонізованого Са в матриксі  як за відсутності, так і в присутності екзогенного Са2+. Маємо підкреслити, що значення [Ca2+]m (за відсутності екзогенного Са2+) були вище за умов інкубації мітохондрій у (Mg2+)-, ніж у (Mg2+,ATP)-вмісному середо­вищі. Також було встановлено, що інкубація ізольованих мітохондрій з досліджуваними калікс[4]аренами супроводжується зміною об’єму мітохондрій: середній гідродинамічний діаметр мітохондрій зменшується за інкубації в присутності С-1012, С-1021, C-1023 та збільшується у разі з С-1011. Зауважимо, зміна об’єму мітохондрій може суттєво позначитись на фізіо­логії цих органел. Таким чином, ми показали, що короткотермінова інкубація (5 хв) мітохондрій у присутності калікс[4]аренів (10 мкМ), які в своїй структурі містять від двох до чотирьох халконамідних груп, збільшує рівень поляризації мембран мітохондрій, рівень іонізованого Са в матриксі та модулює об’єм мітохондрій.
Ключові слова: міометрій, мітохондрії, [Ca(2+)](m), Mg(2+), ATP, калікс[4]аренхалконаміди.

Адаптаційна відповідь ацинарних клітин підшлункової залози щурів на деполяризацію внутрішньої мембрани мітохондрій

Б. О. Манько, О. О. Білонога, В. В. Манько

Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
e-mail: bohdan.manko@lnu.edu.ua

Отримано: 06 грудня 2018; Затверджено: 14 березня 2019

Залежність роз’єднаного дихання інтактних панкреатичних ацинусів від субстратів окислення та функціонального стану клітини не досліджено. У роботі реєстрували базальну швидкість та швидкість FCCP-стимульованого дихання ізольованих панкреатичних ацинусів за допомогою електрода Кларка і оцінювали мембранний потенціал мітохондрій за інтенсивністю флуоресценції родаміну 123. Відповідь ацинусів на внесення FCCP характеризували максимальною швидкістю роз’єднаного дихання, оптимальною концентрацією FCCP, прискоренням та сповільненням дихання. Максимальна швид­кість роз’єднаного дихання істотно збільшилася за окислення глюкози + глутаміну (3,03 ± 0,54 в.о.), глюкози + глутаміну + пірувату (2,82 ± 0,51 в.о.), глюкоза + ізоцит­рат (2,71 ± 0,33 в.о.), глюкози + малату (2,75 ± 0,38 в.о.), глюкози + монометилсукцинату (2,64 ± 0,42 в.о.) або глюкози + диметил-α-кетоглутарату (2,36 ± 0,33 в.о.) у порівнянні з максимальною швидкістю роз’єднаного дихання за окислення лише глюкози (1,73–2,02 в.о.) або за відсутності екзогенних субстратів окислення (1,76 ± 0,33 в.о.). Оптимальна концентрація FCCP виявилася найвищою (1,75 мкМ) за окислення суміші глюкози + глутаміну + пірувату та найнижчою (0,5 мкМ) – за окислення екзогенного глутамату або суміші глюкози з такими субстратами, як ізоцитрат, малат, сукцинат або α-кетоглутарат. Прискорення дихання після додавання FCCP було найвищим за окислення диметил-α-кетоглутарату. Після досягання піка швидкості дихання ацинарними клітинами підшлункової залози у багатьох експериментах спостерігалось часозалежне сповільнення швидкості дихання. Це сповільнення дихання збільшувалося за збільшення концентрації FCCP і залежало від субстрату окислення. Найістотнішим воно було за окислення малату та ізоцитрату. Піруват сам по собі чи його комбінація з глутаміном та глюкозою значно знижували деполяризацію внутрішньої мембрани мітохондрій, спричинену дією FCCP, а також підвищували коефіцієнт еластичності залежності дихання від зміни мембранного потенціалу. Отже, суміш пірувату, глутаміну та глюкози є оптимальною для підтримання адаптивної здатності мітохондрій панкреатичних ацинусів відповідати на деполяризацію їхньої внутрішньої мембрани.

Активність мітохондріальних ензимів катаболізму ендогенних альдегідів за умов ацетамінофеніндукованої гепатотоксичності

О. М. Волощук, Г. П. Копильчук, Ю. І. Мішина

Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Інститут біології, хімії та біоресурсів;
e-mail: o.voloschuk@chnu.edu.ua

У роботі вивчали активність альдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3), альде­гідредуктази (КФ 1.1.1.21), вміст ТБК-активних продуктів і карбонільних похідних протеїнів у мітохондріальній фракції печінки щурів за умов ацетамінофеніндукованого гепатиту та аліментарної депривації протеїну. Встановлено, що найвираженіше зниження активності досліджуваних ензимів спостерігалося в мітохондріальній фракції печінки щурів із токсичним ураженням, які утримувалися в умовах дефіциту харчового протеїну. Водночас у мітохондріях печінки тварин цієї групи встановлено накопичення ТБК-активних продуктів та протеїнових карбоніл-дериватів. Висловлюється припущення, що накопичення альдегідних продуктів окислювального пошкодження ліпідів та протеїнів на фоні зниження активності ензимів, які забезпечують їх катаболізм, може бути основою одного з механізмів мітохондріальної дисфункції в умовах токсичного ураження печінки за аліментарної депривації протеїну.

Калікс[4]арен С-956 – ефективний інгібітор Н(+)-Са(2+)-обмінника в мітохондріях гладенького м’яза

Г. В. Данилович1, О. В. Коломієць1, Ю. В. Данилович1, Р. В. Родік2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ

Показано, що калікс[4]арен С-956 виявляв виражений концентраційнозалежний (10–100 мкМ) гальмівний вплив на Н+-Са2+-обмінник внутрішньої мітохондріальної мембрани міоцитів матки щурів (Kі 35,1 ± 7,9 мкМ). Інгібувальний ефект калікс[4]арену С-956 супроводжувався зниженням початкової швидкості V0 та збільшенням величини характеристичного часу τ1/2 ΔрН-індукованого виходу Са2+. Вод­ночас зазначений калікс[4]арен не впливав на  енергозалежну акумуляцію Са2+ мітохондріями. Отже, дія калікс[4]арену може бути спрямована на зростання концентрації Са2+ в матриксі мітохондрій. За змінами флуоресценції Са2+-чутливого барвника Fluo-4 в мітохондріях, що відображають транспорт Са2+ з ізольованих органел, запропоновано розрахунок основних кінетичних параметрів транспортного процесу для випадків ненульового стаціонарного рівня. Такий підхід можна застосовувати для кінетичного аналізу експоненціального зниження флуоресцентної відповіді будь-якого зонда за схожих експериментальних умов.

Біосинтез оксиду азоту з L-аргініну. Особливості утворення та функціональна роль NO в мітохондріях

Г. В. Данилович, Т. В. Богач, Ю. В. Данилович

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua

В огляді проаналізовано сучасні дані щодо біохімічних закономірностей біосинтезу оксиду азоту із L-аргініну в клітинах ссавців за нормоксичних умов. Розглянуто структуру та особливості регуляції ізоформ NO-синтази. Акценти зроблено на новітніх уявленнях про компартменталізацію в клітинах окремих ізоформ цього ензиму та можливості спрямованого транспорту оксиду азоту в судинній стінці. Центральне місце в огляді приділено питанням ендогенного утворення NO в мітохондріях та його вірогідному фізіологічному значенню. Подано і власні результати по ідентифікації оксиду азоту в мітохондріях гладенького м’яза матки, біохімічні характеристики цього процесу, обговорено можливу роль NO в регуляції транспорту Са2+ в мітохондріях.

Біохімічний механiзм дії о,п′-ДДД на кору надниркових залоз

О. С. Микоша, О. І. Ковзун

ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України», Київ;
e-mail: asmikosha@gmail.com

В огляді наведено дані щодо біохімічного механізму дії о,п’-дихлордифенілдихлоретану (о,п’-ДДД, мітотан), який використовується для лікування раку кори надниркових залоз і хвороби Кушинга. Під впливом препарату виникають численні біохімічні зміни в корі надниркових залоз і порушується структура мітохондрій. При цьому істотно знижується утворення кортикостероїдних гормонів. Однією з можливих причин цього може бути зниження рівня NADPH через пригнічення активності систем його відновлення і підвищеної витрати для відновлення глутатіону глутатіонредуктазою. У надниркових залозах о,п’-ДДД частково метаболізується і його основним метаболітом є о,п’-дихлордифенілоцтова кислота (з точки зору кількості). Однак спроби знайти серед метаболітів фізіологічно активний компонент не мали успіху. Найвираженіші зміни, спричинені о,п’-ДДД, знайдено в мітохондріях коркового шару надниркових залоз: пригнічується дихання на рівні IV і I комплексів, знижується вміст протеїнів цих комплексів, змінюється фосфоліпідний склад тканини і знижується вміст дифосфатидилгліцеролу – найважливішого компонента мембран мітохондрій. На нашу думку, о,п’-ДДД завдяки високій ліпофільності накопичується в мембранах мітохондрій і зумовлює їх конформаційні порушення з подальшим порушенням функції. Встановлено, що о,п’-ДДД є інгібітором ацил-CоА-холестерол-ацилтрансферази (АХАТ, SOAT1). Через це в адренокортикоцитах накопичується вільний холестерол, виникає стрес ендоплазматичного ретикулума, розвивається набухання мітохондрій і активуються каспази. Посилення апоптозу призводить до зменшення функції залози і зниження її маси.

Ca(2+)-залежна регуляція концентрації Ca(2+) в мітохондріях міометрія. II. Вплив Ca(2+) на поляризацію мембран мітохондрій та [Ca(2+)](m)

Л. Г. Бабіч, С. Г. Шликов, А. М. Кушнарьова, С. О. Костерін

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: babich@biochem.kiev.ua

Відомо, що іони Cа регулюють акумуляцію їх у мітохондріях. Проте механізм цього явища й досі є предметом дискусій. У цій роботі ми показали, що іони Са безпосередньо чи опосередковано регулюють рівень поляризації мембран мітохондрій міометрія. Зокрема, внесення 100 мкM Ca2+ до середовища інкубації супроводжується деполяризацією мітохондріальних мембран. Також було досліджено вплив Ca2+ на [Ca2+]m. Ізольовані мітохондрії міометрія попередньо інкубували за відсутності або у присутності 10 мкM Са2+, після чого в інкубаційне середовище додавали 100 мкM Са2+. Досліди проводили в трьох сере­довищах, а саме, без ATP та Mg2+ (0-середовище), у присутності 3 мM Mg2+ (Mg-середовище) та 3 мM Mg2+ + 3 мM ATP (Mg,ATP-середовище). Показано, що ефект 10 мкM Са2+ був різним за різних умов, а саме, у 0- та Mg-середовищі значення [Ca2+]m збільшувались, тоді як у Mg,ATP-середовищі статистично вірогідні зміни не було зареєстровано. Попередня інкубація мітохондрій з 10 мкM Са2+ не впливала на значення [Ca2+]m після внесення в середовище інкубації 100 мкM Са2+. Значення [Ca2+]m після внесення 100 мкM Са2+ були однаковими за інкубації мітохондрій в 0- та Mg,ATP-середовищі та дещо менше у Mg-середовищі. Також встановлено, що попередня інкубація мітохондрій з 10 мкM Са2+ у 0- та Mg-середовищах зменшувала індуковані додаванням 100 мкM Са2+ зміни величини нормованої флуоресценції Fluo, проте у Mg,ATP-середовищі такі зміни зареєстровано не було. Дійшли висновку про те, що обмін Са2+ в мітохондріях міометрія регулюється його концентрацією як у зовнішньому середовищі, так і в матриксі. Склад середовища інкубації має істотний вплив на [Са2+]m за відсутності катіона в зовнішньому середовищі. Припускається, що незначне збільшення [Са2+]m перед додаванням 100 мкM Са2+ може позитивно позначитись на функціональній активності мітохондрій.

Використання методології мереж Петрі для імітаційного моделювання набухання мітохондрій

Ю. В. Данилович, О. Ю. Чуніхін, Г. В. Данилович, О. В. Коломієць

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua

Із використанням методу фотонної кореляційної спектроскопії, який дозволяє дослідити зміни гідродинамічного діаметра частинок у суспензії, показано, що Са2+ у надвисоких концентраціях (більше 10 мМ) індукує набухання ізольованих мітохондрій. Збільшення гідродинамічного діаметра, зумовлене зростанням неспецифічної проникності мітохондріальних мембран до іонів Са, Са2+-перевантаженням матриксу, активацією АТР- та Са2+-чутливих K+-каналів, а також циклоспорин-чутливої пори перехідної провідності. Для формалізації експериментальних даних та оцінки відповідності результатів теоретичним передбаченням була розроблена імітаційна модель із застосуванням методології гібридних функціональних мереж Петрі.

Регуляція функціонування АТР-чутливого K(+)-каналу мітохондрій міометрія активними формами кисню

О. Б. Вадзюк, Ю. Ю. Мазур, С. О. Костерін

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України,Київ;
e-mail: vadzyuk@biochem.kiev.ua

У попередніх роботах, виконаних на ізольованих мітохондріях матки щурів, нами було показано функціонування АТР-чутливого K+-каналу (мітоKАТР). Його регуляція у клітинах міометрія не є достатньо вивченою. Тому дослідження активації мітоKАТР в умовах окисного стресу є актуальним.
Відомо, що активні форми кисню (АФК), які генеруються за окисного стресу, можуть не тільки індукувати апоптоз, але також опосередковувати захист клітини від стресу. Активацію мітоKАТР АФК, що забезпечує виживання клітини в умовах окисного стресу, було показано на клітинах мозку та серця. Але відомостей стосовно регуляції АФК цієї структури у клітинах матки немає. Тому метою нашої роботи було дослідження впливу АФК на активацію мітоKАТР у клітинах матки щурів.
Окисний стрес в ізольованих міоцитах щурів індукували ротеноном (50 мкМ). Було продемонстровано масоване утворення АФК та гіперполяризацію мітохондріальної мембрани у присутності ротенону. Активація мітоKАТР селективним активатором діазоксидом призводила до деполяризації мітохондріальної мембрани, яка усувалась селективним блокатором цієї структури глібенкламідом (20 мкМ). Діазоксид виявляв дозозалежний ефект на потенціал мітохондрій в діапазоні концентрацій від 500 нМ до 75 мкМ. Максимальний ефект спостерігається при 25 мкМ діазоксиду. Уявна константа спорідненості діазоксиду до мітоKАТР (‹K1/2р ) у присутності ротенону становить (1,24 ± 0,21)∙10-6 М. Діазоксид також деполяризує мітохондріальну мембрану в умовах нормоксії, але ‹K1/2› в цьому разі є більшою і становить (5,01 ± 1,47)·10-6 М.
Скавенджер активних форм кисню (АФК) N-ацетилцистеїн (NAC)(0,5–1 мМ) успішно попереджає деполяризацію мітохондріальної мембрани діазоксидом в умовах окисного стресу, спричиненого ротеноном. Одержані нами дані свідчать, що зв’язування АФК N-ацетилцистеїном в умовах окисного стресу попереджає активацію мітоKАТР. Дійшли висновку, що АФК регулюють активність мітоKАТР.