Tag Archives: мітохондрії
Активність мітохондріальних ензимів катаболізму ендогенних альдегідів за умов ацетамінофеніндукованої гепатотоксичності
О. М. Волощук, Г. П. Копильчук, Ю. І. Мішина
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Інститут біології, хімії та біоресурсів;
e-mail: o.voloschuk@chnu.edu.ua
У роботі вивчали активність альдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3), альдегідредуктази (КФ 1.1.1.21), вміст ТБК-активних продуктів і карбонільних похідних протеїнів у мітохондріальній фракції печінки щурів за умов ацетамінофеніндукованого гепатиту та аліментарної депривації протеїну. Встановлено, що найвираженіше зниження активності досліджуваних ензимів спостерігалося в мітохондріальній фракції печінки щурів із токсичним ураженням, які утримувалися в умовах дефіциту харчового протеїну. Водночас у мітохондріях печінки тварин цієї групи встановлено накопичення ТБК-активних продуктів та протеїнових карбоніл-дериватів. Висловлюється припущення, що накопичення альдегідних продуктів окислювального пошкодження ліпідів та протеїнів на фоні зниження активності ензимів, які забезпечують їх катаболізм, може бути основою одного з механізмів мітохондріальної дисфункції в умовах токсичного ураження печінки за аліментарної депривації протеїну.
Калікс[4]арен С-956 – ефективний інгібітор Н(+)-Са(2+)-обмінника в мітохондріях гладенького м’яза
Г. В. Данилович1, О. В. Коломієць1, Ю. В. Данилович1, Р. В. Родік2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ
Показано, що калікс[4]арен С-956 виявляв виражений концентраційнозалежний (10–100 мкМ) гальмівний вплив на Н+-Са2+-обмінник внутрішньої мітохондріальної мембрани міоцитів матки щурів (Kі 35,1 ± 7,9 мкМ). Інгібувальний ефект калікс[4]арену С-956 супроводжувався зниженням початкової швидкості V0 та збільшенням величини характеристичного часу τ1/2 ΔрН-індукованого виходу Са2+. Водночас зазначений калікс[4]арен не впливав на енергозалежну акумуляцію Са2+ мітохондріями. Отже, дія калікс[4]арену може бути спрямована на зростання концентрації Са2+ в матриксі мітохондрій. За змінами флуоресценції Са2+-чутливого барвника Fluo-4 в мітохондріях, що відображають транспорт Са2+ з ізольованих органел, запропоновано розрахунок основних кінетичних параметрів транспортного процесу для випадків ненульового стаціонарного рівня. Такий підхід можна застосовувати для кінетичного аналізу експоненціального зниження флуоресцентної відповіді будь-якого зонда за схожих експериментальних умов.
Біосинтез оксиду азоту з L-аргініну. Особливості утворення та функціональна роль NO в мітохондріях
Г. В. Данилович, Т. В. Богач, Ю. В. Данилович
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua
В огляді проаналізовано сучасні дані щодо біохімічних закономірностей біосинтезу оксиду азоту із L-аргініну в клітинах ссавців за нормоксичних умов. Розглянуто структуру та особливості регуляції ізоформ NO-синтази. Акценти зроблено на новітніх уявленнях про компартменталізацію в клітинах окремих ізоформ цього ензиму та можливості спрямованого транспорту оксиду азоту в судинній стінці. Центральне місце в огляді приділено питанням ендогенного утворення NO в мітохондріях та його вірогідному фізіологічному значенню. Подано і власні результати по ідентифікації оксиду азоту в мітохондріях гладенького м’яза матки, біохімічні характеристики цього процесу, обговорено можливу роль NO в регуляції транспорту Са2+ в мітохондріях.
Біохімічний механiзм дії о,п′-ДДД на кору надниркових залоз
О. С. Микоша, О. І. Ковзун
ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України», Київ;
e-mail: asmikosha@gmail.com
В огляді наведено дані щодо біохімічного механізму дії о,п’-дихлордифенілдихлоретану (о,п’-ДДД, мітотан), який використовується для лікування раку кори надниркових залоз і хвороби Кушинга. Під впливом препарату виникають численні біохімічні зміни в корі надниркових залоз і порушується структура мітохондрій. При цьому істотно знижується утворення кортикостероїдних гормонів. Однією з можливих причин цього може бути зниження рівня NADPH через пригнічення активності систем його відновлення і підвищеної витрати для відновлення глутатіону глутатіонредуктазою. У надниркових залозах о,п’-ДДД частково метаболізується і його основним метаболітом є о,п’-дихлордифенілоцтова кислота (з точки зору кількості). Однак спроби знайти серед метаболітів фізіологічно активний компонент не мали успіху. Найвираженіші зміни, спричинені о,п’-ДДД, знайдено в мітохондріях коркового шару надниркових залоз: пригнічується дихання на рівні IV і I комплексів, знижується вміст протеїнів цих комплексів, змінюється фосфоліпідний склад тканини і знижується вміст дифосфатидилгліцеролу – найважливішого компонента мембран мітохондрій. На нашу думку, о,п’-ДДД завдяки високій ліпофільності накопичується в мембранах мітохондрій і зумовлює їх конформаційні порушення з подальшим порушенням функції. Встановлено, що о,п’-ДДД є інгібітором ацил-CоА-холестерол-ацилтрансферази (АХАТ, SOAT1). Через це в адренокортикоцитах накопичується вільний холестерол, виникає стрес ендоплазматичного ретикулума, розвивається набухання мітохондрій і активуються каспази. Посилення апоптозу призводить до зменшення функції залози і зниження її маси.
Ca(2+)-залежна регуляція концентрації Ca(2+) в мітохондріях міометрія. II. Вплив Ca(2+) на поляризацію мембран мітохондрій та [Ca(2+)](m)
Л. Г. Бабіч, С. Г. Шликов, А. М. Кушнарьова, С. О. Костерін
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: babich@biochem.kiev.ua
Відомо, що іони Cа регулюють акумуляцію їх у мітохондріях. Проте механізм цього явища й досі є предметом дискусій. У цій роботі ми показали, що іони Са безпосередньо чи опосередковано регулюють рівень поляризації мембран мітохондрій міометрія. Зокрема, внесення 100 мкM Ca2+ до середовища інкубації супроводжується деполяризацією мітохондріальних мембран. Також було досліджено вплив Ca2+ на [Ca2+]m. Ізольовані мітохондрії міометрія попередньо інкубували за відсутності або у присутності 10 мкM Са2+, після чого в інкубаційне середовище додавали 100 мкM Са2+. Досліди проводили в трьох середовищах, а саме, без ATP та Mg2+ (0-середовище), у присутності 3 мM Mg2+ (Mg-середовище) та 3 мM Mg2+ + 3 мM ATP (Mg,ATP-середовище). Показано, що ефект 10 мкM Са2+ був різним за різних умов, а саме, у 0- та Mg-середовищі значення [Ca2+]m збільшувались, тоді як у Mg,ATP-середовищі статистично вірогідні зміни не було зареєстровано. Попередня інкубація мітохондрій з 10 мкM Са2+ не впливала на значення [Ca2+]m після внесення в середовище інкубації 100 мкM Са2+. Значення [Ca2+]m після внесення 100 мкM Са2+ були однаковими за інкубації мітохондрій в 0- та Mg,ATP-середовищі та дещо менше у Mg-середовищі. Також встановлено, що попередня інкубація мітохондрій з 10 мкM Са2+ у 0- та Mg-середовищах зменшувала індуковані додаванням 100 мкM Са2+ зміни величини нормованої флуоресценції Fluo, проте у Mg,ATP-середовищі такі зміни зареєстровано не було. Дійшли висновку про те, що обмін Са2+ в мітохондріях міометрія регулюється його концентрацією як у зовнішньому середовищі, так і в матриксі. Склад середовища інкубації має істотний вплив на [Са2+]m за відсутності катіона в зовнішньому середовищі. Припускається, що незначне збільшення [Са2+]m перед додаванням 100 мкM Са2+ може позитивно позначитись на функціональній активності мітохондрій.
Використання методології мереж Петрі для імітаційного моделювання набухання мітохондрій
Ю. В. Данилович, О. Ю. Чуніхін, Г. В. Данилович, О. В. Коломієць
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua
Із використанням методу фотонної кореляційної спектроскопії, який дозволяє дослідити зміни гідродинамічного діаметра частинок у суспензії, показано, що Са2+ у надвисоких концентраціях (більше 10 мМ) індукує набухання ізольованих мітохондрій. Збільшення гідродинамічного діаметра, зумовлене зростанням неспецифічної проникності мітохондріальних мембран до іонів Са, Са2+-перевантаженням матриксу, активацією АТР- та Са2+-чутливих K+-каналів, а також циклоспорин-чутливої пори перехідної провідності. Для формалізації експериментальних даних та оцінки відповідності результатів теоретичним передбаченням була розроблена імітаційна модель із застосуванням методології гібридних функціональних мереж Петрі.
Регуляція функціонування АТР-чутливого K(+)-каналу мітохондрій міометрія активними формами кисню
О. Б. Вадзюк, Ю. Ю. Мазур, С. О. Костерін
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України,Київ;
e-mail: vadzyuk@biochem.kiev.ua
У попередніх роботах, виконаних на ізольованих мітохондріях матки щурів, нами було показано функціонування АТР-чутливого K+-каналу (мітоKАТР). Його регуляція у клітинах міометрія не є достатньо вивченою. Тому дослідження активації мітоKАТР в умовах окисного стресу є актуальним.
Відомо, що активні форми кисню (АФК), які генеруються за окисного стресу, можуть не тільки індукувати апоптоз, але також опосередковувати захист клітини від стресу. Активацію мітоKАТР АФК, що забезпечує виживання клітини в умовах окисного стресу, було показано на клітинах мозку та серця. Але відомостей стосовно регуляції АФК цієї структури у клітинах матки немає. Тому метою нашої роботи було дослідження впливу АФК на активацію мітоKАТР у клітинах матки щурів.
Окисний стрес в ізольованих міоцитах щурів індукували ротеноном (50 мкМ). Було продемонстровано масоване утворення АФК та гіперполяризацію мітохондріальної мембрани у присутності ротенону. Активація мітоKАТР селективним активатором діазоксидом призводила до деполяризації мітохондріальної мембрани, яка усувалась селективним блокатором цієї структури глібенкламідом (20 мкМ). Діазоксид виявляв дозозалежний ефект на потенціал мітохондрій в діапазоні концентрацій від 500 нМ до 75 мкМ. Максимальний ефект спостерігається при 25 мкМ діазоксиду. Уявна константа спорідненості діазоксиду до мітоKАТР (‹K1/2›р ) у присутності ротенону становить (1,24 ± 0,21)∙10-6 М. Діазоксид також деполяризує мітохондріальну мембрану в умовах нормоксії, але ‹K1/2› в цьому разі є більшою і становить (5,01 ± 1,47)·10-6 М.
Скавенджер активних форм кисню (АФК) N-ацетилцистеїн (NAC)(0,5–1 мМ) успішно попереджає деполяризацію мітохондріальної мембрани діазоксидом в умовах окисного стресу, спричиненого ротеноном. Одержані нами дані свідчать, що зв’язування АФК N-ацетилцистеїном в умовах окисного стресу попереджає активацію мітоKАТР. Дійшли висновку, що АФК регулюють активність мітоKАТР.
Ефекти α-токоферолу і його аналогів на запрограмовану загибель тимоцитів щурів, індуковану інгібіторами клітинних протеїнкіназ
Г. В. Петрова, Н. В. Делеменчук, Г. В. Донченко
Інститут біохімії їм О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-maіl: petrova@bіochem.kіev.ua
Встановлено, що α-токоферол (α-ТФ) виявляє цитопротекторну дію за індукції апоптозу тимоцитів щурів інгібіторами внутрішньоклітинних протеїнкіназ – стауроспорином і форболовим ефіром у високій концентрації, а також некрозу клітин, спричиненого сфінгозином. Ефект α-ТФ на загибель тимоцитів, яка зумовлена інгібітором протеїнфосфатази типу 2А – окадаєвою кислотою – набагато менш виражений. Одержані дані свідчать про те, що відома здатність α-ТФ до інгібування ПКС і активації протеїнфосфатази типу 2А не є основним механізмом його цитопротекторної дії. Часткове відтворення ефектів α-ТФ його аналогом α-токоферилацетатом, нездатним вступати в окисно-відновлювані реакції, і відсутність впливу на досліджувані процеси антиоксиданту N-ацетил-L-цистеїну у цьому разі не підтверджують антиоксидантний механізм дії α-ТФ. Інгібування α-ТФ-м виходу до цитозолю клітин цитохрому с свідчить про реалізацію його цитопротекторної дії на рівні мітохондріальних мембран. Припускається існування універсального механізму цитопротекторної дії α-ТФ, який не залежить від природи апоптогенів та реалізується на загальному для більшості з них етапі індукції загибелі клітин. Як такий запропоновано попередження дисфункції мітохондрій шляхом стабілізації мембран мітохондрій і зниження їх пермеабілізації за дії α-ТФ.
Зміни поляризації плазматичної та внутрішньої мітохондріальної мембран клітин міометрія за дії каліксаренів – інгібіторів Na(+), K(+)-АТР-ази плазматичної мембрани
Г. В. Данилович1, Ю. В. Данилович1, О. В. Коломієць1,
С. О. Костерін1, Р. В. Родік2, С. О. Черенок2, В. І. Кальченко2,
О. Ю. Чуніхін1, В. Ф. Горчев1, С. О. Карахім1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua;
vik@bpci.kiev.ua
Досліджено вплив супрамолекулярних макроциклічних сполук – калікс[4]аренів С-97, С-99, С-107 – уабаїноподібних високоафінних інгібіторів Na+, K+-АТР-ази – на рівень поляризації плазматичної та мітохондріальної мембран гладеньком’язових клітин матки щурів. Вивчено дію цих сполук на характеристичні розміри міоцитів.
Із використанням лазерної конфокальної мікроскопії та специфічного щодо мітохондрій барвника MitoTracker Orange CM-H2TMRos доведено, що потенціалчутливий флуоресцентний зонд DiOC6(3) взаємодіє із мітохондріями в умовах штучного колапса потенціалу на плазматичній мембрані, спричиненого передінкубацією міоцитів з уабаїном (1 мМ).
Експериментами за допомогою методу протокової цитофлуориметрії та DiOC6(3) з’ясовано, що каліксарени С-97, С-99 та С-107 у концентраціях 50–100 нМ, які відповідають уявним константам інгібування натрієвої помпи сарколеми гладенького м’яза, зумовлюють деполяризацію плазматичної мембрани (на рівні 30% відносно контрольних значень) в умовах штучного колапсу мітохондріального потенціалу в разі передінкубації міоцитів у присутності 5 мМ азиду натрію.
В умовах штучної деполяризації сарколеми уабаїном каліксарени С-97, С-99 та С-107 у концентрації 100 нМ зумовлюють транзієнтне зростання мембранного потенціалу мітохондрій, яке сягає 40% від контрольного рівня і триває близько 5 хв. Одержані результати підтверджено даними лазерної конфокальної мікроскопії, згідно з якими С-99 та С-107 спричинюють істотне зростання флуоресценції навантажених DiOC6(3) міоцитів, передінкубованих з уабаїном.
За допомогою методу фотонної кореляційної спектроскопії доведено, що С-99 та С-107 спричинюють зростання характеристичних розмірів міоцитів.
Ендоплазматично-мітохондріальна Са(2+)-функціональна одиниця: залежність дихання секреторних клітин від активності ріанодин- та ІФ(3)-чутливих Са(2+)-каналів
О. Ю. Великопольська, Б. О. Манько, В. В. Манько
Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
e-mail: vvmanko@franko.lviv.ua
Досліджено залежність функціонування мітохондрій від активності каналів вивільнення Са2+ з використанням полярографічної реєстрації утилізації O2 (за допомогою кисневого електрода Кларка) суспензією слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. (комара-дергуна, або дзвінця). Щоб забезпечити проникнення екзогенних субстратів дихального ланцюга, клітини піддавали АТP-пермеабілізації. Встановлено, що сама по собі активація P2X-рецепторів (як і P2Y-рецепторів) плазматичної мембрани екзогенним АТP чи АDP не змінює ендогенного дихання суспензії слинних залоз. Тобто на функціональну активність мітохондрій не впливає надходження Са2+ із позаклітинного середовища, хоча самі мітохондрії розміщені вздовж базальної частини плазматичної мембрани. Активація ріанодинчутливих Са2+-каналів інтенсифікує ендогенне і стимульоване сумішшю пірувату і малату дихання, але не сукцинатстимульоване дихання. Ні активація ІФ3-чутливих Са2+-каналів (опосередковано через активацію P2Y-рецепторів), ні їх інгібування не змінюють ендогенного дихання. Проте інгібування ІФ3-чутливих Са2+-каналів за допомогою 2-аміноетоксифенілборату інтенсифікує сукцинатстимульоване дихання. Наведені факти свідчать, що вивільнений із внутрішньоклітинного депо через канали Са2+ змінює функціональну активність мітохондрій, і беззастережно підтверджують наявність ендоплазматично-мітохондріальної Ca2+-функціональної одиниці в секреторних клітинах слинних залоз личинки дзвінця. У стані спокою ендоплазматично-мітохондріальної Ca2+-функціональної одиниці спостерігається спонтанна активність ІФ3-чутливих Са2+-каналів ендоплазматичного ретикулума, вивільнюваний ними Са2+ акумулюється уніпортером у мітохондріях і модулює окисні процеси. Активація ріанодинчутливих Са2+-каналів спричиняє перехід ендоплазматично-мітохондріальної Са2+-функціональної одиниці у стан активності, необхідний для інтенсифікації клітинного дихання та окисного фосфорилювання. Передбачається, що перехід ендоплазматично-мітохондріальної Са2+-функціональної одиниці у стан інактивації (пригнічення каналів вивільнення Са2+ за надмірної його концентрації в цитозолі) обмежує тривалість процесів трансдукції сигналу в часі, має захисний характер і перешкоджає розвитку апоптичних процесів у клітинах.