Ukr.Biochem.J. 2025; Том 97, № 6, листопад-грудень, c. 93-104

doi: https://doi.org/10.15407/ubj97.06.093

Виділення та характеристика препарату з колагеназною активністю зі слинних залоз Rapana venosa

21.04.2026   Uncategorized

В. А. Топтіков*, Є. А. Шестеренко, Ю. А. Шестеренко

Лабораторія медичної біотехнології та ензимології, відділ біомедицини,
Фізико-хімічний інститут імені О. В. Богатського НАН України, Одеса;
*e-mail: v.a.toptikov@gmail.com

Отримано: 02 липня 2025; Виправлено: 28 серпня 2025;
Затверджено: 28 листопада 2025; Доступно онлайн: 23 грудня 2025

Колагенази знайшли практичне застосування як у медицині, так і в харчовій промисловості, однак пошук нових джерел колагеназ залишається актуальним напрямом досліджень. Rapana, хижий молюск, що переважно живиться двостулковими, багатими на сполучну тканину, привертає увагу як потенційне джерело колагенолітичних ензимів. Метою цього дослідження було виділити препарат із колагеназною активністю зі слинних залоз Rapana venosa та охарактеризувати його властивості. Екстракт слинних залоз очищували методом осадження ацетоном із подальшою обробкою сульфатом амонію. Електрофорез здійснювали за протоколом Леммлі в умовах відновлення та без нього. Протеолітичну активність визначали спектрофотометрично з використанням колагену або желатину як субстрату. Показано, що препарат складався з п’яти протеїнових фракцій і проявляв ензиматичний поліморфізм. Було досягнуто очищення у 13,8 раза колагеназної активності, при цьому щонайменше 22% загальних протеїнів виявляли колагенолітичну активність, тоді як 88% – желатинолітичну. Оптимум активності препарату знаходився в кислому (pH 4,5) та лужному (pH ~ 9,5) діапазонах, а температурний оптимум становив 46°C. За кімнатної температури близько 90% активності зберігалося протягом 8 год. Інгібітори серинових протеаз не впливали на активність ензиму, тоді як хелатори іонів металів повністю її пригнічували. Відновлювальні агенти, що активують SH-групи, підвищували активність ензиму, тоді як регенерація дисульфідних зв’язків або модифікація SH-груп знижували її. Отримані дані свідчать, що колагеназно-активний ензимний препарат зі слинних залоз Rapana venosa переважно складається з металопротеїназ і цистеїнових протеаз та характеризується високою стабільністю.

Ключові слова: , , , ,

Посилання:

  1. Beard HA, Barniol-Xicota M, Yang J, Verhelst SHL. Discovery of Cellular Roles of Intramembrane Proteases. ACS Chem Biol. 2019;14(11):2372-2388. PubMed, CrossRef
  2. Bhagwat PK, Dandge PB. Collagen and collagenolytic proteases: a review. Biocatal Agric Biotechnol. 2018;15:43-55. CrossRef
  3. Del Bigio MR, Seyoum G. Effect of matrix metalloproteinase inhibitors on rat embryo development in vitro. Cells Tissues Organs. 1999;165(2):67-73. PubMed, CrossRef
  4. Detry B, Erpicum C, Paupert J, Blacher S, Maillard C, Bruyère F, Pendeville H, Remacle T, Lambert V, Balsat C, Ormenese S, Lamaye F, Janssens E, Moons L, Cataldo D, Kridelka F, Carmeliet P, Thiry M, Foidart JM, Struman I, Noël A. Matrix metalloproteinase-2 governs lymphatic vessel formation as an interstitial collagenase. Blood. 2012;119(21):5048-5056. PubMed, CrossRef
  5. Inada M, Wang Y, Byrne MH, Rahman MU, Miyaura C, López-Otín C, Krane SM. Critical roles for collagenase-3 (Mmp13) in development of growth plate cartilage and in endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101(49):17192-17197. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  6. Reponen P, Leivo I, Sahlberg C, Apte SS, Olsen BR, Thesleff I, Tryggvason K. 92-kDa type IV collagenase and TIMP-3, but not 72-kDa type IV collagenase or TIMP-1 or TIMP-2, are highly expressed during mouse embryo implantation. Dev Dyn. 1995;202(4):388-396. PubMed, CrossRef
  7. Stolow MA, Bauzon DD, Li J, Sedgwick T, Liang VC, Sang QA, Shi YB. Identification and characterization of a novel collagenase in Xenopus laevis: possible roles during frog development. Mol Biol Cell. 1996;7(10):1471-1483. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  8. Cowan RW, Mak IW, Colterjohn N, Singh G, Ghert M. Collagenase expression and activity in the stromal cells from giant cell tumour of bone. Bone. 2009;44(5):865-871. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  9. Fukumoto Y, Deguchi JO, Libby P, Rabkin-Aikawa E, Sakata Y, Chin MT, Hill CC, Lawler PR, Varo N, Schoen FJ, Krane SM, Aikawa M. Genetically determined resistance to collagenase action augments interstitial collagen accumulation in atherosclerotic plaques. Circulation. 2004;110(14):1953-1959. PubMed, CrossRef
  10. Hussain AA, Lee Y, Marshall J. High molecular-weight gelatinase species of human Bruch’s membrane: compositional analyses and age-related changes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;51(5):2363-2371. PubMed, CrossRef
  11. Löffek S, Schilling O, Franzke CW. Series “matrix metalloproteinases in lung health and disease”: Biological role of matrix metalloproteinases: a critical balance. Eur Respir J. 2011;38(1):191-208. PubMed, CrossRef
  12. Nakatani T, Partridge NC. Bone proteinases. In: Bilezikian JP, Raisz LG, Martin TJ, editors. Principles of Bone Biology. 3rd ed. Elsevier; 2020. p. 379-399. CrossRef
  13. Shingleton WD, Hodges DJ, Brick P, Cawston TE. Collagenase: a key enzyme in collagen turnover. Biochem Cell Biol. 1996;74(6):759-775. PubMed, CrossRef
  14. Holmbeck K, Birkedal-Hansen H. Collagenases. In: Encyclopedia of Biological Chemistry. Elsevier Inc.,2013. P. 542-544. CrossRef
  15. Mótyán JA, Tóth F, Tőzsér J. Research applications of proteolytic enzymes in molecular biology. Biomolecules. 2013;3(4):923-942. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  16. Hatz RA, von Jan NCS, Schildberg FW. The role of collagenase in wound healing. In: Westerhof W, Vanscheidt W. (Eds.). Proteolytic Enzymes and Wound Healing. Springer, 1994: 75-88. CrossRef
  17. Alipour H, Raz A, Zakeri S, Dinparast DN. Therapeutic applications of collagenase (metalloproteases): a review. Asian Pac J Trop Biomed. 2016;6(11):975-981. CrossRef
  18. Shekhter AB, Balakireva AV, Kuznetsova NV, Vukolova MN, Litvitsky PF, Zamyatnin AA Jr. Collagenolytic Enzymes and their Applications in Biomedicine. Curr Med Chem. 2019;26(3):487-505. PubMed, CrossRef
  19. Pal GK, PV S. Microbial collagenases: challenges and prospects in production and potential applications in food and nutrition. RSC Adv. 2016;6(40):33763-33780. CrossRef
  20. Toptikov VA, Totskiy VM, Alekseyeva TG, Kovtun OO. Peculiarities of proteinase activity in digestive tract of the veined rapa whelk (Rapana venosa) from the north-western section of the Black Sea. Hydrobiol J. 2015;51(1):79-89. CrossRef
  21. Patterson ML, Atkinson SJ, Knäuper V, Murphy G. Specific collagenolysis by gelatinase A, MMP-2, is determined by the hemopexin domain and not the fibronectin-like domain. FEBS Lett. 2001;503(2-3):158-162. PubMed, CrossRef
  22. Dekina S, Romanovska I, Sevastyanov O, Shesterenko Y, Ryjak A, Varbanets L, Natalia D, Muratov E. Development and characterization of chitosan/polyvinyl alcohol polymer material with elastolytic and collagenolytic activities. Enzyme Microb Technol. 2020;132:109399. PubMed, CrossRef
  23. Mandl I. Collagenase. Science. 1970;169(3951):1234-1238. PubMed, CrossRef
  24. Hartree EF. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Anal Biochem. 1972;48(2):422-427. PubMed, CrossRef
  25. Dotsenko OI, Taradina GV. Biophysics. Enzymatic kinetics. Dynamic models of biological processes. Theory. Laboratory practice. Vinnytsia: Vasyl Stus DonNU; 2017. 183 p. (In Ukrainian).
  26. He Y, Hang D, Lu M. A simple and practical method for the oxidation of thiols to disulfides at mild conditions without solvents. Phosphorus Sulfur Silicon Relat Elem. 2012;187(9):1118-1124. CrossRef
  27. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. PubMed, CrossRef
  28. Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. Purification and characterization of a collagenolytic protease from the filefish, Novoden modestrus. J Biochem Mol Biol. 2002;35(2):165-171. PubMed, CrossRef
  29. Baehaki A. Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11.4. Afr J Microbiol Res. 2012;6(10): 2373-2379. CrossRef
  30. Daboor SM, Budge SM, Ghaly AE, Brooks MS, Dave D. Isolation and activation of collagenase from fish processing waste. Adv Biosci Biotechnol. 2012;3(3):191-203. CrossRef
  31. Młynarczyk G, Gudowska-Sawczuk M, Mroczko B, Bruczko-Goralewska M, Romanowicz L, Tokarzewicz A. Higher Content but No Specific Activity in Gelatinase B (MMP-9) Compared with Gelatinase A (MMP-2) in Human Renal Carcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(22):5475. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  32. Ricci S, D’Esposito V, Oriente F, Formisano P, Di Carlo A. Substrate-zymography: a still worthwhile method for gelatinases analysis in biological samples. Clin Chem Lab Med. 2016;54(8):1281-1290. PubMed, CrossRef
  33. Suphatharaprateep W, Cheirsilp B, Jongjareonrak A. Production and properties of two collagenases from bacteria and their application for collagen extraction. N Biotechnol. 2011;28(6):649-655. PubMed, CrossRef
  34. Panwar P, Du X, Sharma V, Lamour G, Castro M, Li H, Brömme D. Effects of cysteine proteases on the structural and mechanical properties of collagen fibers. J Biol Chem. 2013;288(8):5940-5950. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  35. Aguda AH, Panwar P, Du X, Nguyen NT, Brayer GD, Brömme D. Structural basis of collagen fiber degradation by cathepsin K. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111(49):17474-17479. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  36. Tallant C, Marrero A, Gomis-Rüth FX. Matrix metalloproteinases: fold and function of their catalytic domains. Biochim Biophys Acta. 2010;1803(1):20-28.
    PubMed, CrossRef
  37. Shaikh N, Agwuocha S. Types of lectins and their therapeutic potential. J Surv Fish Sci. 2023;10(2):106-117.
  38. Guo L, Hussain AA, Limb GA, Marshall J. Age-dependent variation in metalloproteinase activity of isolated human Bruch’s membrane and choroid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999;40(11):2676-2682. PubMed
  39. Van Wart HE, Birkedal-Hansen H. The cysteine switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87(14):5578-5582. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  40. Wu S, Zhou X, Jin Z, Chen H. Collagenases and their inhibitors: a review. Collagen Leather. 2023;5:19. CrossRef
  41. Shoulders MD, Raines RT. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 2009;78:929-958. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  42. Selent J, Kaleta J, Li Z, Lalmanach G, Brömme D. Selective inhibition of the collagenase activity of cathepsin K. J Biol Chem. 2007;282(22):16492-16501. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  43. Fallas JA, Gauba V, Hartgerink JD. Solution structure of an ABC collagen heterotrimer reveals a single-register helix stabilized by electrostatic interactions. J Biol Chem. 2009;284(39):26851-26859. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  44. Gurry T, Nerenberg PS, Stultz CM. The contribution of interchain salt bridges to triple-helical stability in collagen. Biophys J. 2010;98(11):2634-2643. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  45. Kotch FW, Raines RT. Self-assembly of synthetic collagen triple helices. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(9):3028-3033. PubMed, PubMedCentral, CrossRef
  46. Parimal S, Garde S, Cramer SM. Effect of guanidine and arginine on protein-ligand interactions in multimodal cation-exchange chromatography. Biotechnol Prog. 2017;33(2):435-447. PubMed, CrossRef
Creative CommonsThis work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.