Tag Archives: міометрій

Інгібування Nа(+),K(+)-АТРази та активація міозинової АТРази калікс[4]ареном С-107 стимулює тонічну складову скоротливої активності ізольованих гладеньких м’язів

Т. О. Векліч1, Р. Д. Лабинцева1, О. А. Шкрабак1, О. В. Цимбалюк2,
Р. В. Родік3, В. І. Кальченко3, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут високих технологій, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
3Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: veklich@biochem.kiev.ua; otsymbal@bigmir.net; manli@ioch.kiev.ua

Отримано: 04 липня 2019; Затверджено: 29 листопада 2019

Метою дослідження було показати, що синтетична сполука калікс[4]арен С-107 виявляє кілька унікальних біохімічних та фізіологічних ефектів на гладенькі м’язи і є перспективною для медичного застосування. Зокрема, цей калікс[4]арен є ефективним інгібітором Nа+,K+-АТРази міометрія (І50 = 54 ± 6 нМ), селективним відносно інших АТР-гідролаз плазматичної мембрани та одночасно активатором ензиматичної активності міозинової АТРази гладеньких м’язів (А50 = 9,6 ± 0,7 мкМ). Такі реципрокні біохімічні ефекти спрямовані на одну фізіологічну відповідь, а саме стимулювання скоротливої активності гладеньких м’язів, що було продемонстровано на різних ізольованих гладеньких м’язах тензометричним методом. А саме: калікс[4]арен С-107 стимулює підвищення тонічної складової спричинених окситоцином скорочень міометрія, а також зумовлених гіперкалієвим розчином та ацетилхоліном скорочень м’яза caecum товстого кишечника, та утримання цього підвищеного тонусу тривалий час. Отже, калікс[4]арен С-107 є перспективною речовиною для посилення базального тонусу та/або активації скорочувальної активності гладеньком’язових органів у разі їхніх гіпотонічних дисфункційних порушень.

Ефекти калікс[4]арен­халконамідів на мітохондрії міометрія

С. Г. Шликов1, А. М. Кушнарьова-Вакал1, А. В. Силенко1, Л. Г. Бабіч1,
О. Ю. Чуніхін1, О. А. Єсипенко2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: sshlykov@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ

Отримано: 19 листопада 2018; Затверджено: 14 березня 2019

Мітохондрії відіграють ключову роль у найважливіших функціях клітин. Каліксарени – це супрамолекулярні сполуки, які широко застосовуються в біоорганічній хімії та біохімії. Мета цієї роботи – дослідити ефекти калікс[4]аренів, які містять у своїй структурі дві (С-1012 і С-1021), три (С 1023 і С-1024) та чотири (С-1011) халконамідні групи, на поляризацію мембран мітохондрій міометрія, на рівень іонізованого Са в матриксі цих органел та на середній гідродинамічний діаметр мітохондрій. Встановлено, що інкубація пермеабілізованих клітин міометрія з калікс[4]аренами, що містять від двох до чотирьох халконамідних груп супроводжується збільшенням рівня поляризації мембран мітохондрій міометрія. Відомо, що акумуляція Са2+ в мітохондріях є потенціалзалежним процесом. Отже, подальші експерименти було спрямовано на дослідження впливу калікс[4]аренхалкон­амідів на концентрацію іонізованого Са в матриксі мітохондрій ([Ca2+]m). Усі досліджувані калікс[4]арени збільшували рівень іонізованого Са в матриксі  як за відсутності, так і в присутності екзогенного Са2+. Маємо підкреслити, що значення [Ca2+]m (за відсутності екзогенного Са2+) були вище за умов інкубації мітохондрій у (Mg2+)-, ніж у (Mg2+,ATP)-вмісному середо­вищі. Також було встановлено, що інкубація ізольованих мітохондрій з досліджуваними калікс[4]аренами супроводжується зміною об’єму мітохондрій: середній гідродинамічний діаметр мітохондрій зменшується за інкубації в присутності С-1012, С-1021, C-1023 та збільшується у разі з С-1011. Зауважимо, зміна об’єму мітохондрій може суттєво позначитись на фізіо­логії цих органел. Таким чином, ми показали, що короткотермінова інкубація (5 хв) мітохондрій у присутності калікс[4]аренів (10 мкМ), які в своїй структурі містять від двох до чотирьох халконамідних груп, збільшує рівень поляризації мембран мітохондрій, рівень іонізованого Са в матриксі та модулює об’єм мітохондрій.
Ключові слова: міометрій, мітохондрії, [Ca(2+)](m), Mg(2+), ATP, калікс[4]аренхалконаміди.

Калікс[4]арен С-956 селективно інгібує Са(2+),Mg(2+)-АТРазу плазматичної мембрани клітин міометрія

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Ю. В. Ніконішина1, Р. В. Родік2, В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: veklich@biochem.kiev.ua; manli@ioch.kiev.ua

Із використанням методів ензиматичного та кінетичного аналізу продемонстровано, що калікс[4]арен С-956 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил-(феніл-сульфоніліміно)метиламіно-25,27-діоктилокси-26,28-дипропоксикалікс[4]арен) у концентрації 100 мкМ чинив найбільшу інгібіторну дію на Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичної мембрани порівняно з іншими аналогами цього калікс[4]арену і не впливав на питому активність інших мембранних АТРаз. За допомогою конфокальної мікроскопії з використанням кальційчутливого флуоресцентного зонда fluo-4 показано, що внесення калікс[4]арену С-956 до іммобілізованих міоцитів матки зумовлює зростання рівня внутрішньоклітинної концентрації  Са2+. Аналіз впливу калікс[4]арену С-956 на ефективний гідродинамічний діаметр міоцитів міометрія продемонстрував, що додавання розчину цієї сполуки до суспензії міоцитів зменшує вказаний показник на 45,5 ± 9,4% подібно до дії утеротоніка окситоцину.

Взаємозв’язок між концентрацією іонізованого Са і функціонуванням мітохондрій

Л. Г. Бабіч1, С. Г. Шликов1, А. М. Кушнарьова-Вакал1, Н. І. Купиняк2,
В. В. Манько2, В. П. Фомін3, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: babich@biochem.kiev.ua;
2Львівський національний університет імені Івана Франка, Україна;
3Університет Делаверу, Ньюарк, США

Мета дослідження – показати взаємозв’язок між концентрацією іонізованого Са ([Ca2+]m) в матриксі мітохондрій та функціональною активністю цих органел. [Ca2+]m визначали за допомогою флуоресцентного барвника Fluo-4, AM. Загальну акумуляцію Ca2+ в мітохондріях визначали за допомогою ізотопного методу з використанням 45Ca2+. Встановлено, що інкубація мітохондрій міометрія в середовищі, до складу якого входить 3 мM Mg2+, призводить до низького рівня [Ca2+]m. Подальше додавання 100 мкM Ca2+ супроводжувалось збільшенням концентрації іонізованого Са в 8 разів, проте, за таких умов, реєстрували низький рівень загальної акумуляції цього катіона. Нормована флуоресценція Са2+-чутливого зонда Fluo-4 у відповідь на додавання Ca2+ була понад 2,5 умовних одиниць. У той же час, [Ca2+]m була значно вище за інкубації мітохондрій в присутності 3 мМ АТР та 3 мМ Mg2+. Подальше додавання 100 мкM Ca2+ супроводжувалось збільшенням концентрації іонізованого Са лише у 2,4 раза, проте реєструвався високий рівень загальної акумуляції цього катіона. У присутності 3 мМ АТР та 3 мМ Mg2+ нормована флуоресценція Са2+-чутливого зонда Fluo-4 у відповідь на додавання Ca2+ була меншою за 1,3 умовних одиниць. У мітохондріях печінки найвищу швидкість поглинання кисню реєстрували в присутності сукцинату, ніж пірувату або α-кетоглутарату. Зауважимо, що у присутності сукцинату нормована флуоресценція Са2+-чутливого зонда Fluo-4 в мітохондріях печінки у відповідь на додавання Ca2+ була меншою за 1,3 умовних одиниць. Отже, дійшли висновку про те, що низький рівень іонізованого Са в матриксі мітохондрій корелює з низькою функціональною активністю і, нав­паки, високий рівень [Ca2+]m корелює з високою функціональною активністю. Зроблено припущення, що  зміни нормованої флуоресценції Са2+-чутливого зонда у відповідь на додавання Ca2+ можна використовувати як тест на функціональну мітохондрійну активність: менше значення нормованої флуоресценції – більше функціональна активність.

Ca(2+)-залежна регуляція концентрації Ca(2+) в мітохондріях міометрія. II. Вплив Ca(2+) на поляризацію мембран мітохондрій та [Ca(2+)](m)

Л. Г. Бабіч, С. Г. Шликов, А. М. Кушнарьова, С. О. Костерін

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: babich@biochem.kiev.ua

Відомо, що іони Cа регулюють акумуляцію їх у мітохондріях. Проте механізм цього явища й досі є предметом дискусій. У цій роботі ми показали, що іони Са безпосередньо чи опосередковано регулюють рівень поляризації мембран мітохондрій міометрія. Зокрема, внесення 100 мкM Ca2+ до середовища інкубації супроводжується деполяризацією мітохондріальних мембран. Також було досліджено вплив Ca2+ на [Ca2+]m. Ізольовані мітохондрії міометрія попередньо інкубували за відсутності або у присутності 10 мкM Са2+, після чого в інкубаційне середовище додавали 100 мкM Са2+. Досліди проводили в трьох сере­довищах, а саме, без ATP та Mg2+ (0-середовище), у присутності 3 мM Mg2+ (Mg-середовище) та 3 мM Mg2+ + 3 мM ATP (Mg,ATP-середовище). Показано, що ефект 10 мкM Са2+ був різним за різних умов, а саме, у 0- та Mg-середовищі значення [Ca2+]m збільшувались, тоді як у Mg,ATP-середовищі статистично вірогідні зміни не було зареєстровано. Попередня інкубація мітохондрій з 10 мкM Са2+ не впливала на значення [Ca2+]m після внесення в середовище інкубації 100 мкM Са2+. Значення [Ca2+]m після внесення 100 мкM Са2+ були однаковими за інкубації мітохондрій в 0- та Mg,ATP-середовищі та дещо менше у Mg-середовищі. Також встановлено, що попередня інкубація мітохондрій з 10 мкM Са2+ у 0- та Mg-середовищах зменшувала індуковані додаванням 100 мкM Са2+ зміни величини нормованої флуоресценції Fluo, проте у Mg,ATP-середовищі такі зміни зареєстровано не було. Дійшли висновку про те, що обмін Са2+ в мітохондріях міометрія регулюється його концентрацією як у зовнішньому середовищі, так і в матриксі. Склад середовища інкубації має істотний вплив на [Са2+]m за відсутності катіона в зовнішньому середовищі. Припускається, що незначне збільшення [Са2+]m перед додаванням 100 мкM Са2+ може позитивно позначитись на функціональній активності мітохондрій.

Ca(2+)-залежна регуляція концентрації Ca(2+) в мітохондріях міометрія. I. Ефекти трифлуоперазину на поляризацію мітохондріальних мембран та [Ca(2+)](m)

Л. Г. Бабіч, С. Г. Шликов, А. М. Кушнарьова, С. О. Костерін

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: babich@biochem.kiev.ua

Са2+-залежна регуляція обміну Ca2+ в мітохондріях відбувається за участю кальмодуліну. Раніше ми показали, що антагоністи кальмодуліну знижують рівень поляризації мітохондріальних мембран та спричинюють ріст концентрації іонізованого Са як у матриксі мітохондрій, так і в цитозолі клітин. У цій роботі вивчався залежний від концентрації вплив трифлуоперазину на рівень поляризації мітохондріальних мембран. Показано, що K0,5 становить 24,4 ± 5,0 μM (n = 10). Коефіцієнт Хілла дорівнює 2,0 ± 0,2, що вказує на наявність двох центрів зв’язування трифлуоперазину на мембрані мітохондрій. Також було досліджено зміни [Ca2+]m за умов інкубації мітохондрій в середовищах різного складу, а саме: без ATP та іонів Mg (0-середовище), з 3 мM Mg (Mg-середовище) та те, що містило 3 мM Mg + 3 мM ATP (Mg,ATP-середовище). Встановлено, що склад середовища інкубації впливав на значення [Ca2+]m за відсутності екзогенного Ca2+ та не впливав у присутності цього катіона. Попередня інкубація мітохондрій в середовищах різного складу із 25 μM трифлуоперазином не впливала на значення [Ca2+]m як до, так і після додавання 100 μM Ca2+ до інкубаційного середовища. Таким чином, трифлуоперазин спричинює деполяризацію мітохондріальних мембран і цей ефект залежить від його концентрації. Проте попередня інкубація мітохондрій з 25 μM три­флуоперазином, яка супроводжується 50% зниженням поляризації мембран, не впливає на значення [Ca2+]m.

Вплив каліксарену С-107 на кінетичні параметри Nа(+),K(+)-АТР-ази плазматичної мембрани міоцитів матки

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Р. В. Родік2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@bpci.kiev.ua

В експериментах, виконаних на суспензії перфорованих плазматичних мембран клітин міометрія, досліджували інгібуючу дію каліксарену С-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арен) на кінетичні характеристики Na+,K+-АТР-азної активності.
Показано, що каліксарен С-107, інгібуючи Na+,K+-АТР-азу, не змінює кінетичні параметри залежності швидкості реакції (Km, nH) від концентрації субстрату. Константа активації ензиму хлоридом магнію Kа має складний двофазний характер залежності від концентрації каліксарену С-107 – збільшується вдвічі з ростом концентрації каліксарену С-107 до 50 нМ, а за подальшого підвищення концентрації каліксарену знижується до майже контрольного рівня. При цьому величина коефіцієнта кооперативності Хілла nH активуючої дії MgCl2 практично не змінюється у присутності каліксарену С-107. Як АТР, так і MgCl2 не впливає на константу інгібування Na+,K+-АТР-ази каліксареном С-107, але збільшення концентрації зазначених речовин призводить до зростання коефіцієнта кооперативності nH інгібування АТР-азної реакції каліксареном С-107.

Каліксарен С-107 збільшує спорідненість Nа(+),K(+)-АТР-ази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин до уабаїну

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, Р. В. Родік2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: vik@ioch.kiev.ua

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, обробленій 0,1%-им розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію каліксарену С-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арен) на Na+,K+-АТР-азну активність.
Доведено, що ця сполука здатна збільшувати спорідненість ензиму до уабаїну: уявна константа інгібування 0,5) Na+,K+-АТР-ази уабаїном зменшується з 26,9 ± 1,3 мкM дo 10,9 ± 0,6 мкM. Проте сам уабаїн не впливає на спорідненість Na+,K+-АТР-ази до зазначеного калікс[4]арену.

Порівняльне дослідження впливу калікс[4]арену С-99 та його аналогів на Nа(+),K(+)-ATP-азну активність у плазматичній мембрані міоцитів матки

Т. О. Векліч1, О. А. Шкрабак1, С. О. Черенок2,
В. І. Кальченко2, С. О. Костерін1

1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут органічної хімії НАН України, Київ;
e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@ioch.kiev.ua

З метою визначення ролі структурної організації молекули калікс[4]арену С-99 у проявленні інгібіторної дії на Nа+,K+-АТР-азу плазматичних мембран клітин міометрія досліджено дію структурно подібних до нього калікс[4]аренів С-296, С-297, С-424, С-425, С-426, С-427 на активність цього ензиму. Показано, що каліксарени С-296 та С-297 (мають дві додаткові пропокси-групи на нижньому вінці макроциклу) є менш ефективними інгібіторами Na+,K+-АТР-ази порівняно з каліксареном С-99.  Каліксарени С-425 та С-427 (мають на верхньому вінці макроциклу відповідно три та чотири залишки фосфонових кислот) також інгібують активність Na+,K+-АТР-ази з нижчою ефективністю порівняно з каліксареном С-99. Каліксарен С-424, в якого на верхньому вінці знаходяться лише два залишки карбонової кислоти, та каліксарен С-426, що містить на верхньому вінці кетометилфосфонові залишки замість гідроксиметилфосфонових залишків у каліксарені С-99, не впливають на активність Nа+,K+-АТР-ази. Зроблено відповідні висновки щодо ролі певних хімічних груп каліксарену С-99 у його взаємодії  з Nа+,K+-АТР-азою.

Інгібіторний вплив калікс[4]арену С-90 на ензиматичну активність транспортних Са(2+),Mg(2+)-АТРаз плазматичної мембрани та саркоплазматичного ретикулума міометрія

Т. О. Векліч

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
e-mail: veklich@biochem.kiev.ua

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран та клітинах міометрія, оброблених 0,1%-им розчином дигітоніну, показано, що калікс[4]арен С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(феніл­сульфоніліміно)метиламіно-25,26,27,28-тетра­пропокси-калікс[4]арен) ефектив­ніше інгібує ензиматичну активність Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани, ніж відповідну активність у саркоплазматичному ретикулумі (величини коефіцієнта інгібування І0,5 становлять 20,2 ± 0,5 та 57,0 ± 1,4 мкМ для Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани та саркоплазматичного ретикулума відповідно (n = 5)). Дослідили кінетичні закономірності інгібувальної дії калікс[4]арену С-90 на Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичної мембрани та саркоплазматичного ретикулума. Цей інгібітор діє на обидві помпи за механізмом повного неконкурентного інгібування. Під впливом калікс[4]арену С-90 відбувається підвищення концентрації Са2+ в клітині та зменшується ефективний гідродинамічний діаметр гладеньком’язових клітин подібно до дії утеротоніка окситоцину.